肺部CD103+DC在過敏性哮喘過程中作用的初步研究.pdf

1、目的：
　　利用免疫佐劑明礬（Aluminium hydroxide,ALUM）與雞卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）腹腔致敏小鼠，并聯(lián)合OVA霧化誘導(dǎo)小鼠過敏性哮喘，研究肺部CD103+DC在過敏性哮喘中作用。
　　利用C57BL/6、Batf3-/-缺陷鼠和CD11c-DTR小鼠來研究肺部CD103+DC在過敏性哮喘中的作用。本論文主要以分子與細(xì)胞免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)方法，研究在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展過程中，肺部CD10

2、3+DC在獲得性免疫反應(yīng)中功能的變化，以明確其可能的作用機(jī)制。為探索過敏性哮喘等呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防、藥物過敏提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　首先，選用7-8周雌性C57BL/6小鼠，以免疫佐劑明礬（alum）加入雞卵清蛋白（OVA），震蕩混勻充分乳化OVA后，給予小鼠腹腔注射做初次致敏，第14天再次相同劑量進(jìn)行第二次腹腔致敏，然后在28-30天之間用1％OVA連續(xù)霧化3天，每次30min，構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型

3、。
　　其次，應(yīng)用相關(guān)轉(zhuǎn)基因和基因敲除純合小鼠及其嵌合小鼠建立哮喘模型，建立Batf3-/-嵌合小鼠過敏性哮喘模型。各小組小鼠連續(xù)霧化3天后，摘取眼球取血，頸椎脫臼處死，取支氣管肺泡灌洗液、肺引流淋巴結(jié)、肺臟制備單細(xì)胞，以FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測相關(guān)的肺泡巨噬細(xì)胞(AM)、樹突狀細(xì)胞亞群（DCs）、淋巴細(xì)胞亞群及其相關(guān)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平；以ELISA的方法檢測灌洗液中IL4、IL-5、血清中IgG1、IgG2b表達(dá)

4、水平；以Real-time PCR檢測肺組織、肺引流淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)水平；對肺部組織切片進(jìn)行PAS、HE染色，觀察肺部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)狀態(tài)、肺部組織形態(tài)的變化情況。
　　再次，對CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠頸椎脫臼處死，取其骨髓制單細(xì)胞懸液，尾靜脈回輸至輻照后的C57BL/6小鼠，制備CD11c-DTR嵌合鼠，8周后檢測嵌合情況，霧化前一天氣管內(nèi)注射DT清除肺部DC，建立CD11c-DTR嵌合小鼠過敏性哮喘模型。各小

5、組小鼠連續(xù)霧化3天后，摘取眼球取血，頸椎脫臼處死，取支氣管肺泡灌洗液、肺引流淋巴結(jié)、肺臟制備單細(xì)胞，以FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測相關(guān)的肺泡巨噬細(xì)胞(AM)、樹突狀細(xì)胞亞群（DCs）、淋巴細(xì)胞亞群及其相關(guān)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平；以ELISA的方法檢測灌洗液中IL4、IL-5和血清中IgG1、IgG2b等的表達(dá)水平；用Real-time PCR檢測肺組織IL-4、IL-5 RNA表達(dá)水平；對肺部組織切片進(jìn)行PAS、HE染色，觀察肺

6、部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)狀態(tài)、肺部組織形態(tài)的變化情況。
　　最后，用體內(nèi)趨化實驗方法，取正常C57BL/6小鼠剔除背部毛發(fā)，用5ml注射器皮下注入3ml氣體，在小鼠背部形成氣泡，然后三天之后再注射一次，分選C57BL/6哮喘模型中和對照小鼠CD103+DC、CD11b+DC、AM注射到小鼠后背氣泡中，12h用PBS沖洗氣泡，用流式細(xì)胞儀檢測氣泡嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞數(shù)目。肺部趨化實驗，用流式細(xì)胞儀分選C57BL/6小鼠CD103+DC、

7、CD11b+DC氣管內(nèi)注射正常C57BL/6，48h觀察肺部嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞細(xì)胞數(shù)變化。
　　結(jié)果：
　　在C57BL/6小鼠哮喘模型中，流式細(xì)胞儀檢測肺灌洗液中單細(xì)胞懸液以及肺單細(xì)胞懸液，發(fā)現(xiàn)肺單細(xì)胞懸液以及肺灌洗液中單細(xì)胞懸液的嗜酸性粒細(xì)胞、AM、DCs、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)，哮喘模型組比對照組顯著升高。肺部切片PAS/HE染色，在肺部呼吸道周圍炎癥細(xì)胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度上，哮喘模

8、型組比對照組在炎癥細(xì)胞浸潤程度顯著加重。ELISA方法檢測血清中IgG1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)哮喘模型組比對照組顯著升高，而這兩組IgG2b無差異。從而證明腹腔致敏OVA+ALUM并且OVA霧化組肺部炎癥狀態(tài)嚴(yán)重，并且明顯高于PBS陰性對照組。
　　在Batf3-/-小鼠哮喘模型中，用FACS Aria Ⅱ的含9色流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)肺單細(xì)胞懸液以及支氣管肺灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞、DCs、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)，Batf3-/-小鼠哮喘模

9、型組比對照哮喘組顯著升高；肺組織切片HE/PAS染色，在呼吸道周圍炎癥細(xì)胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度方面，Batf3-/-小鼠哮喘模型組比對照哮喘組顯著減輕；ELISA方法檢測血清中IgG1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Batf3-/-小鼠哮喘模型組比對照哮喘組顯著減輕，而這兩組IgG2b無差異；肺組織提取RNA做Realtime-PCR,發(fā)現(xiàn)Batf3-/-小鼠哮喘模型組比對照哮喘組在IL-4、IL-5基因水平上顯著降低。說明肺部CD103+DC

10、缺失后會導(dǎo)致肺部炎癥明顯下降，CD4+T增殖明顯降低。
　　CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因嵌合小鼠哮喘模型，氣管內(nèi)注射DT可以清除肺部DC，我們的結(jié)果表明該處理方式清除CD103+DC的比例顯著高于CD11b+DC。CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因嵌合小鼠霧化前一天氣管內(nèi)注射DT清除肺部DC，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)支氣管肺灌洗液以及肺部單細(xì)胞懸液的嗜酸性粒細(xì)胞、DCs、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)，在哮喘模型中氣管內(nèi)注射DT比PBS顯著下降；肺部切

11、片HE/PAS染色，在哮喘模型中氣管內(nèi)注射DT組比PBS組在呼吸道周圍炎癥細(xì)胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度上顯著減輕；ELISA方法檢測血清中IgG1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在哮喘模型中氣管內(nèi)注射DT組比PBS組顯著減輕，而這兩組IgG2b無差異。從而證明說明在OVA再刺激階段，DT清除CD103+DC后會導(dǎo)致肺部炎癥明顯下降，CD4+T增殖明顯降低。
　　在體內(nèi)趨化實驗中，分選C57BL/6哮喘模型中和對照小鼠CD103+DC、CD11

12、b+DC、AM注射到小鼠后背氣泡中，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)嗜酸性細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞顯著增加。用流式細(xì)胞儀分選C57BL/6小鼠CD103+DC、CD11b+DC氣管內(nèi)注射正常C57BL/6，48h流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)嗜酸性細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞顯著增加。說明肺部DC亞群中CD103+DC直接趨化T淋巴細(xì)胞到達(dá)肺部，從而引起肺部TH2反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1、肺部CD103+DC在過敏性哮喘的肺部炎癥過程中有促進(jìn)炎癥作用；
　　2、