豬SIM1、PPARγ2和UCP3基因分子特性及遺傳效應(yīng)研究.pdf

1、利用RT-PCR和RACE技術(shù)，以金華豬下丘腦cDNA為模板擴增、克隆豬SIM1基因全長cDNA序列，得到3714 bp的cDNA序列。其中包括一個2301 bp的開放閱讀框461 bp的5’非翻譯區(qū)和952 bp的3’非翻譯區(qū)。利用生物信息學(xué)軟件對SIM1基因序列、編碼蛋白結(jié)構(gòu)、功能等特征進行分析和預(yù)測。結(jié)果表明：豬SIM1全長cDNA序列與牛、人、黑猩猩、獼猴的同源性分別達到92.8％，94.5％，91.4％和94.4％。豬SIM1

2、基因具有bHLH-PAS家族完整保守結(jié)構(gòu)域，而且結(jié)構(gòu)域在進化中高度保守。pSIM1起源上和牛具有較近的親緣關(guān)系。
　　 應(yīng)用real-time PCR方法研究SIM1基因的mRNA表達譜及在脂肪組織的發(fā)育表達規(guī)律。結(jié)果表明，SIM1基因在檢測的十個組織內(nèi)均有表達，其中在腎臟表達量最高，肌肉次之，脂肪組織的表達量最低。在金華豬和大約克脂肪組織不同生長階段的發(fā)育表達發(fā)現(xiàn)，SIM1基因在20d-120d日齡表達量持續(xù)增長，在150d后

3、表達量下降，但不同日齡之間表達量差異不顯著。SIM1基因在大約克所有生長階段的脂肪組織內(nèi)表達量均高于金華豬。
　　 應(yīng)用Western blot技術(shù)研究SIM1蛋白的組織表達譜和在肌肉組織的發(fā)育表達規(guī)律。結(jié)果表明：SIM1蛋白在7個待檢組織內(nèi)都檢測到。其中大腦和下丘腦的表達量最高，在皮脂內(nèi)的表達最低，表達模式和mRNA水平檢測相似。在金華豬不同生長階段的肌肉組織內(nèi)的發(fā)育表達研究發(fā)現(xiàn)，SIM1蛋白僅在20d和45d有微量表達，之后

4、的階段幾乎沒有表達。在大約克豬肌肉組織內(nèi)進行相同實驗，結(jié)果表明：SIM1蛋白在大約克不同生長階段均有表達，在90d和120d表達量最高，150d后表達量逐漸減少。金華豬的背膘厚和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于大約克，推測SIM1的表達量和脂肪性狀值呈現(xiàn)負相關(guān)，而且SIM1可能通過參與Leptin-Melanocortin-Oxytocin途徑調(diào)控飲食和能量代謝，進而導(dǎo)致脂肪代謝改變。本試驗新發(fā)現(xiàn)SIM1基因SNPs包括C534T。和T1677C位

5、點。應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)，分析兩處多態(tài)位點在國內(nèi)外豬種的分布，結(jié)果表明在C534T位點，國內(nèi)豬種的C等位基因頻率高于國外豬種，在T1677C位點，只有TT基因型存在于外國豬種內(nèi)。在PJF2代群體內(nèi)進行遺傳效應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)C534T突變位點基因型與BFT、IMF、IMW和后腿肌肉重極顯著相關(guān)(p<0.01)，和后腿脂肪重顯著相關(guān)(p<0.05)。等位基因T攜帶個體有較高的脂肪含量和后腿肌肉重。T1677C座位和BFT、后腿溫度、后腿脂肪

6、重極顯著相關(guān)(p<0.01)，和LEA、后腿pH、后腿肌肉重顯著相關(guān)(p<0.05)。等位基因T可顯著降低肌內(nèi)脂肪含量，同時提高后腿肌肉重和LEA。
　　 擴增金華豬和皮特蘭豬的PPARγ2基因全部外顯子，結(jié)合PCR-SSCP技術(shù)和測序技術(shù)比對分析，發(fā)現(xiàn)A175G(位于Exon1)和G876A(位于Exon5)突變位點。在8個國內(nèi)外豬種內(nèi)分析SNPs的多態(tài)性分布，發(fā)現(xiàn)在A175G位點，A等位基因頻率在外國豬種較高(>75％)，而

7、在國內(nèi)豬種內(nèi)稍低(<67％)。在G876A位點，只在金華豬內(nèi)發(fā)現(xiàn)等位基因A的存在，其他品種內(nèi)均只有GG型，推測等位基因A為金華豬特有。A175G和G876A在PJF2資源群體處于連鎖不平衡狀態(tài)，利用單倍型方法分析基因?qū)χ拘誀畹倪z傳效應(yīng)，結(jié)果表明：PPARγ2基因單倍型和肩部BFT、腰薦結(jié)合部BFT顯著相關(guān)(p<0.05)，同時單倍型和6-7th肋BFT、最后一根肋骨處BFT、后腿重極顯著相關(guān)(p<0.01)。H1H3單倍型個體有較低的

8、后腿重(p<0.01)。H2H3單倍型個體的6-7th肋BFT、最后一根肋骨BFT和腰薦結(jié)合部BFT相比其他單倍型個體高(p<0.01)，肩部BFT以H1H3單倍型個體最高，H2H3次之。由此可知，PPARγ2基因是豬背膘厚脂肪性狀候選基因。
　　 擴增比對金華豬和皮特蘭豬UCP3基因cDNA序列，發(fā)現(xiàn)兩處SNPs：T211C和A448G。利用PCR-RFLP技術(shù)分析SNPs在8個國內(nèi)外豬種內(nèi)的多態(tài)分布，發(fā)現(xiàn)在T221C位點，所

9、有國內(nèi)品種內(nèi)只發(fā)現(xiàn)CC基因型，等位基因T存在于國外豬種內(nèi)。A448G位點，等位基因G在除皮特蘭豬外的所有豬種內(nèi)都有較高的頻率。嵊縣花豬在這兩個位點都純合，在T221C突變位點為CC基因型，在A448G突變位點為GG基因型。在PJF2代資源群體內(nèi)的遺傳效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，T221C位點對脂肪性狀沒有顯著地遺傳效應(yīng)。A448G位點基因型和IMW、IMF以及LEA極顯著相關(guān)(p<0.01)?；蛐秃秃笸萷H值相關(guān)性也接近顯著，GG基因型個體的肩部B