豬TPO、TG、GNAS、TTF-1和TTF-2基因的分子特性研究.pdf

1、甲狀腺激素的作用遍及機(jī)體各處，幾乎機(jī)體的每個(gè)細(xì)胞都是甲狀腺激素作用的靶細(xì)胞，其可以促進(jìn)組織分化、生長(zhǎng)和成熟，促進(jìn)物質(zhì)與能量代謝。甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)是一種糖基化血紅素蛋白，是催化甲狀腺激素合成的關(guān)鍵酶。它參與了兩個(gè)重要的反應(yīng)：甲狀腺球蛋白(TG)酪氨酸殘基的碘化和碘化酪氨酸的偶聯(lián)作用。TG是甲狀腺激素合成的基本原料和場(chǎng)所，甲狀腺素正常的生物合成途徑依賴(lài)于TG結(jié)構(gòu)的完整性。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1，-2(TTF-1,-2)通過(guò)結(jié)合到TG和

2、TPO基因的啟動(dòng)子特異性區(qū)域來(lái)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，另外TTF-1，-2在甲狀腺胚胎發(fā)育的過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。刺激性G蛋白α亞基(GNAS)基因上的失活性突變可導(dǎo)致假性甲狀旁腺功能減退癥，影響甲狀腺的功能，繼而對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。
　　 本研究克隆了豬TG、GNAS、TTF-1和TTF-2完整CDS的mRNA序列：分別對(duì)TPO、TTF-1和TTF-2基因進(jìn)行了染色體定位；通過(guò)熒光定量PCR研究了在豬十六個(gè)組織中的組織表達(dá)譜和在初

3、生、20、45、60、90、120和150日齡甲狀腺組織內(nèi)的發(fā)育表達(dá)譜；尋找了TPO基因的SNP座位和轉(zhuǎn)錄剪切本；分析了TG基因的啟動(dòng)子區(qū)域；并探討了閹割對(duì)GNAS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響。結(jié)果如下：
　　 （1）基于EST序列的電子克隆技術(shù)及人和小鼠同源性較高區(qū)域?qū)δ康幕蛟O(shè)計(jì)引物，以金華豬甲狀腺cDNA為模板擴(kuò)增、克隆并測(cè)序，拼接后克隆獲得了包含完整CDS的豬TG(GenBank GQ261999)、GNAS(GenBank

4、 GU126691)以及TTF-1和TTF-2基因的部分CDS序列。并利用Clustal W、ORF Finder、Signal P2.0、PSORTⅡ等軟件對(duì)TG、GNAS、TTF-1和TTF-2基因的結(jié)構(gòu)、編碼蛋白結(jié)構(gòu)、功能等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。
　　 （2）根據(jù)豬目的基因相應(yīng)的內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)引物，利用豬輻射雜種克隆板(ImpRH)將豬TPO基因定位于SSC3q22-27，連鎖標(biāo)記為SWR201（LOD值3.59）和SW5

5、90（LOD值2.33）；TTF-1基因定位于SSC7q22，連鎖標(biāo)記為NFKB（LOD值11.89）和SW1959（LOD值5.65）；TTF-2基因定位于SSC1q28，連鎖標(biāo)記為SSC11E11（LOD值4.44）。
　　 （3）應(yīng)用real-time Q-PCR方法研究了豬TPO、TG、GNAS、TTF-1和TTF-2在金華豬16種組織中的表達(dá)譜，結(jié)果表明：GNAS呈廣泛表達(dá)；TTF-1基因在甲狀腺中表達(dá)量最高，肺其次、

6、垂體次之，其他組織基本不表達(dá)；TPO、TG和TTF-2基因僅在甲狀腺組織中特異表達(dá)。在甲狀腺組織不同生長(zhǎng)階段的發(fā)育表達(dá)譜表明TPO、TTF-1和GNAS基因在不同生長(zhǎng)階段表達(dá)的差異不顯著；而TG和TTF-2在不同生長(zhǎng)階段表達(dá)的差異較明顯。
　　 （4）通過(guò)對(duì)基因池的“PCR-測(cè)序”，我們發(fā)現(xiàn)了豬TPO基因的多態(tài)座位：C/T63，G/T156，G/C268，C/T333，A/G624，A/G642以及C/T705，在TPO基因的3

7、'非翻譯區(qū)未發(fā)現(xiàn)多態(tài)座位。應(yīng)用PCR-RFLP方法，在豬A/G642座位對(duì)國(guó)內(nèi)外豬種多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明國(guó)內(nèi)豬種（金華豬、岔路黑豬、嘉興黑豬）A基因的頻率高于國(guó)外豬種（大白、長(zhǎng)白、杜洛克）；遺傳效應(yīng)分析表明，在JPF2代豬中，AA基因型個(gè)體的后腿重顯著高于AG和GG基因型。另外，我們還發(fā)現(xiàn)金華豬TPO基因存在兩種新的轉(zhuǎn)錄本：轉(zhuǎn)錄本TPO-2缺少外顯子8；而TPO-3缺少外顯子8、14、15和16。
　　 （5）利用生物信息學(xué)