獼猴桃果實(shí)后熟進(jìn)程中乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件功能及其對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答.pdf

1、本文以獼猴桃(Actinidia)果實(shí)為試材,研究乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)編碼基因在獼猴桃果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和后熟軟化進(jìn)程中的表達(dá)模式,以及對(duì)乙烯(100μl/L)、1-MCP(0.5μl/L)、低溫(0℃)、高溫(35℃)、高CO2(5％)和快速失水(～10％RH空氣)等采后處理的應(yīng)答模式,鑒別參與獼猴桃后熟軟化及采后逆境脅迫應(yīng)答的相關(guān)成員;開展轉(zhuǎn)錄因子級(jí)別元件與果實(shí)后熟軟化相關(guān)基因的互作模式研究,探索基因的作用方向;進(jìn)行部分基因的功能驗(yàn)證,明

2、確其與獼猴桃果實(shí)后熟軟化及逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的功能。主要結(jié)果如下:
　　 1、基于獼猴桃EST數(shù)據(jù)庫(kù),分離得到獼猴桃5個(gè)AdETRs基因、2個(gè)AdCTRs基因、4個(gè)AdEILs基因和14個(gè)AdERFs基因。組織和階段特異性分析結(jié)果表明,除AdERF2不在果實(shí)組織中表達(dá)外,其他成員在根、莖、葉、花和果實(shí)等不同組織中均有分布,這與乙烯的廣泛生理功能相一致;另外,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件編碼基因的大部分成員在果實(shí)發(fā)育初期表達(dá)較強(qiáng),它們可能介導(dǎo)了乙烯

3、參與果實(shí)快速生長(zhǎng)過程。
　　 2、AdETRs家族成員的AdERSla、AdETR2和AdETR3在果實(shí)后熟軟化中表達(dá)增強(qiáng),且受外源乙烯上調(diào),可能是直接“綁定”乙烯的結(jié)合子(binder);而AdETRl表達(dá)伴隨果實(shí)后熟軟化進(jìn)程下降,并受外源乙烯下調(diào),可能是果實(shí)乙烯敏感性感受器(sensor);首次發(fā)現(xiàn)的呈乙烯下調(diào)模式的AdETRl基因,可部分解釋獼猴桃果實(shí)乙烯超敏感性的內(nèi)在分子機(jī)制。AdERSlb對(duì)外源乙烯無(wú)應(yīng)答,它在果實(shí)快速

4、軟化前表達(dá)較強(qiáng),而在果實(shí)完成快速軟化之后表達(dá)下降,并維持在較低水平,表明AdERSlb可能與果實(shí)軟化相關(guān).
　　 3、AdEILs基因家族成員在果實(shí)后熟進(jìn)程中表達(dá)水平較穩(wěn)定,Transient Assay結(jié)果顯示AdEIL2/3可增強(qiáng)AdACOl和.AdXET5啟動(dòng)子活性,表明AdEIL2/3行使轉(zhuǎn)錄激活子功能。轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯示,過量表達(dá)AdEIL2和AdEIL3均可增加擬南芥乙烯合成。AdXET5啟動(dòng)子刪截實(shí)驗(yàn)表明,AdEIL2

5、識(shí)別AdXET5啟動(dòng)子的第1和第3個(gè)結(jié)構(gòu)域,而AdEIL3識(shí)別第1和第2結(jié)構(gòu)域,認(rèn)為同一啟動(dòng)子區(qū)不同結(jié)構(gòu)域在基因互作中具有不同功能,且同一轉(zhuǎn)錄因子家族不同成員的識(shí)別位點(diǎn)也可存在差異。
　　 4、除AdERF2外(不在果實(shí)中表達(dá)),其他13個(gè)AdERFs家族成員在獼猴桃果實(shí)后熟軟化進(jìn)程中呈4種表達(dá)模式,其中AdERF10/14隨果實(shí)后熟軟化表達(dá)增強(qiáng),AdERF4/6轉(zhuǎn)錄本在乙烯躍變高峰后的果實(shí)中大量積累,而AdERF5/9呈組成型

6、表達(dá),其余7個(gè)AdERFs成員在果實(shí)后熟軟化進(jìn)程中表達(dá)下降。分析乙烯、1-MCP處理及ACO敲除的果實(shí),7個(gè)表達(dá)下調(diào)的AdERFs中,AdERF1/7/8/11/12與乙烯無(wú)顯著聯(lián)系,表現(xiàn)為果實(shí)后熟軟化進(jìn)程特異性模式。AdERFs與后熟軟化相關(guān)基因互作結(jié)果表明AdERFs對(duì)含有GCC盒的AdEXP1啟動(dòng)子無(wú)顯著調(diào)控效應(yīng),但AdERF9可抑制AdXET5啟動(dòng)子活性,表明其行使轉(zhuǎn)錄抑制子功能。進(jìn)一步的啟動(dòng)子刪截研究表明,AdERF9始終抑制

7、AdXET5啟動(dòng)子活性,認(rèn)為未知的AdERF9結(jié)合位點(diǎn)可能位于AdXET5啟動(dòng)子的-265至-1區(qū)間。
　　 5、低溫可顯著延緩獼猴桃果實(shí)后熟軟化,且可誘導(dǎo)大部分乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)。這些乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件對(duì)于低溫的應(yīng)答模式,與果實(shí)后熟軟化無(wú)直接聯(lián)系,更可能是相關(guān)基因的逆境應(yīng)答。但AdEILs對(duì)低溫處理的獨(dú)特應(yīng)答模式,表明AdEILs可能是調(diào)控果實(shí)低溫應(yīng)答的關(guān)鍵級(jí)別之一。轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯示,AdEIL3、AdERF1/6/9/13可

8、增強(qiáng)擬南芥植株的低溫抗性。依據(jù)相關(guān)基因?qū)Φ蜏氐膽?yīng)答模式,進(jìn)一步分析了AdETRs和AdERFs基因家族對(duì)采后逆境(高溫、高CO2和快速失水等)的應(yīng)答模式,發(fā)現(xiàn)AdETR3、AdERF1/3/4/11/12/14對(duì)不同的采后非生物逆境的應(yīng)答模式一致,它們可能是獼猴桃AdETRs和AdERFs級(jí)別參與采后逆境應(yīng)答的重要成員。
　　 上述結(jié)果表明,獼猴桃乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同成員不僅參與調(diào)控果實(shí)后熟軟化進(jìn)程,還參與果實(shí)對(duì)采后非生物逆境脅