香蕉MuMADS2基因的功能鑒定.pdf

1、香蕉是世界上最重要的水果之一,被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織定為世界第四大糧食作物。香蕉是一種典型的呼吸躍變型果實(shí),其品質(zhì)形成與調(diào)控是香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,對(duì)其生理學(xué)及分子生物學(xué)研究就成為研究的熱點(diǎn),對(duì)香蕉生產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。分離與果實(shí)成熟相關(guān)的基因進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行功能鑒定就成為重要的研究手段,本研究就是基于這一目的,在前期獲得的一個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因的基礎(chǔ)上,利用模式植物番茄進(jìn)一步探討該基因?qū)麑?shí)以及其他重要農(nóng)學(xué)性狀的調(diào)控作用

2、,從而揭示該轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)ο憬渡L(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)形成與調(diào)控的作用機(jī)理。
　　 本實(shí)驗(yàn)室利用SSH和cDNA微列陣相結(jié)合的方法,首次克隆到香蕉果實(shí)中的一個(gè)MADS-box基因,命名為MuMADS2(Musa MADS-box gone)。生物信息學(xué)和芯片分析表明,該基因編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)采后早期上調(diào)表達(dá)。RT-PCR分析表明,該基因僅在香蕉生殖器官(花和果)中表達(dá),在營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖和葉)中不表達(dá),說(shuō)明MuMADS2的表

3、達(dá)具有器官特異性。熒光定量PCR分析表明,MuMADS2在香蕉正常成熟時(shí),達(dá)到表達(dá)量最高值的時(shí)間在乙烯峰之前,說(shuō)明該基因可能是乙烯的上游調(diào)控因子。所以,認(rèn)為MuMADS2可能在香蕉果實(shí)發(fā)育和乙烯生物合成過(guò)程中起作用。
　　 在此基礎(chǔ)上將MuMADS2克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-m-GFP上,在358啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下,產(chǎn)生MuMADS2-GFP融合蛋白。利用基因槍轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析,結(jié)果表明,該基

4、因所編碼的蛋白主要定位于細(xì)胞核中,與亞細(xì)胞定位的信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相符,符合轉(zhuǎn)錄因子特性。
　　 為了進(jìn)一步在植物體內(nèi)研究MuMADS2基因的功能,將該基因轉(zhuǎn)入番茄,得到37株T0代潮霉素抗性植株?？剐灾仓甑腜CR檢測(cè)結(jié)果表明,其中33株表現(xiàn)為陽(yáng)性。挑選10株表型變化明顯的T0代陽(yáng)性植株進(jìn)行Southern blot檢測(cè),共有8株Southern blot檢測(cè)為陽(yáng)性,而且獲得的轉(zhuǎn)基因植株插入的拷貝數(shù)也有所變化。
　　 選取轉(zhuǎn)

5、基因植株中的53號(hào)株系(L53),它代表了大部分轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)特征。采用RT-PCR的方法對(duì)MuMADS2在L53不同器官的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,該基因在轉(zhuǎn)基因植株的根和葉中表達(dá)量最高,莖和果實(shí)中表達(dá)量較低,而在花和萼片中表達(dá)量很低,甚至不表達(dá).進(jìn)一步對(duì)L53的根系和不同時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行GFP檢測(cè),結(jié)果顯示,幼果果肉、綠熟果果肉、紅熟果果肉和根系的細(xì)胞核中均能檢測(cè)到不同程度的GFP熒光信號(hào),但是根系中的熒光信號(hào)明顯大于果肉。

6、>　　 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn),大部分轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮化、生長(zhǎng)緊湊、節(jié)間短縮、叢生芽、葉片褶皺,顏色暗淡等明顯的性狀變化。轉(zhuǎn)基因植株種子數(shù)顯著低于對(duì)照,且部分植株表現(xiàn)出高度不育,而且轉(zhuǎn)基因番茄的可溶性固形物含量明顯高于對(duì)照。
　　 綜上所述,MuMADS2基因在轉(zhuǎn)基因番茄中控制多個(gè)性狀表現(xiàn),而且因其表達(dá)部位不同所引起的性狀表現(xiàn)也有所不同。在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá),表現(xiàn)為生長(zhǎng)受到抑制,而在生殖器官中表達(dá)則引起不育、可溶性固形物增