玉米ZmLTPL63基因的分離及功能鑒定.pdf

1、植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到高溫、干旱、鹽等多種非生物脅迫的影響。這些逆境可以造成植物體內(nèi)生理代謝障礙，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。為了應(yīng)對(duì)脅迫危害，植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了一套復(fù)雜而精密的防御機(jī)制，包括多重信號(hào)通路、各種轉(zhuǎn)錄因子及功能基因等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Lipid Transfer Proteins, LTPs）在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)及非生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用，但大多數(shù)LTPs的具體作用機(jī)理尚不清楚。
　　本研究

2、根據(jù)玉米熱帶種質(zhì)POB21自選系響應(yīng)高溫和干旱的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異，從中篩選到一個(gè)脅迫響應(yīng)上調(diào)表達(dá)的功能未知 LTPs-like基因。根據(jù)玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)MaizeGDB中B73基因組中參考基因DRMZM2G05208的序列，通過(guò)RT-PCR方法獲得同源克隆，命名為ZmLTPL63。對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式及生物學(xué)功能進(jìn)行系統(tǒng)分析，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）基因序列分析表明，該基因CDS全長(zhǎng)759bp，編碼長(zhǎng)252個(gè)氨基酸

3、的肽鏈。預(yù)測(cè)ZmLTPL63蛋白的分子量約25.9kD，在N末端存在長(zhǎng)度為23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。蛋白具有典型的LTPs結(jié)構(gòu)特征，肽鏈中8個(gè)位置特異的半胱氨酸殘基（8CM）可以配對(duì)產(chǎn)生4個(gè)二硫鍵，4個(gè)α螺旋折疊形成一個(gè)立體的疏水腔，可用來(lái)結(jié)合脂質(zhì)分子。但與典型LTPs相比，ZmLTPL63編碼的氨基酸序列更長(zhǎng)，并且在N端信號(hào)肽和8CM基序之間富含脯氨酸。蛋白種間同源比對(duì)及進(jìn)化分析表明，ZmLTPL63在多種植物中存在同源蛋白，與粟XP_0

4、12699184.1、高粱XP_002439994.1、漸尖二型花屬OEL21002.1、粗山羊草EMT12664.1、二穗短柄草KQK15914.1及水稻BAC65920.1等蛋白存在較高同源性，而與擬南芥AT3G43720同源性較低。
　?。?）通過(guò)qRT-PCR方法分析玉米ZmLTPL63基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明其可以響應(yīng)多種脅迫、植物激素和信號(hào)分子。ZmLTPL63基因的表達(dá)具有一定的組織特異性，在幼苗中的表達(dá)水平表現(xiàn)為根

5、<莖<葉。ZmLTPL63可以受高溫、PEG模擬干旱、鹽（NaCl）誘導(dǎo)表達(dá)。脫落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）和H2O2能顯著上調(diào)ZmLTPL63基因的表達(dá)水平，赤霉素（GA）處理后其表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。
　?。?）為確定ZmLTPL63蛋白的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了pROKII-35S::ZmLTPL63-GFP融合表達(dá)載體并通過(guò)農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染本生煙草葉片。利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光，發(fā)現(xiàn)ZmLTPL63-

6、GFP的熒光只出現(xiàn)在細(xì)胞外周。
　?。?）根據(jù)B73參考基因組序列克隆ZmLTPL63基因編碼區(qū)上游長(zhǎng)1500bp的DNA序列。序列分析軟件預(yù)測(cè)表明啟動(dòng)子存在真菌、高溫、干旱、低溫等多種（非）生物脅迫響應(yīng)元件和MeJA等激素響應(yīng)元件。pBI121-PZmLTPL63::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的X-Gluc染色表明，基因在植株各器官中廣泛表達(dá)，尤其在莖尖和和根尖表達(dá)較高。ABA和H2O2處理能夠增強(qiáng)GUS表達(dá)，說(shuō)明啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控特性

7、與基因表達(dá)特性一致。
　?。?）組成型超表達(dá)ZmLTPL63基因能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱和鹽的非生物脅迫抗性。在脅迫條件下，超表達(dá)ZmLTPL63轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型幼苗根生長(zhǎng)更快，成苗的存活率更高；轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉盤在滲透脅迫下的褪綠黃化明顯慢于野生型；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉片失水速率也低于野生型。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株在干旱和高鹽脅迫下ROS的積累量較低，抗氧化酶的活性更高，丙二醛含量較少，對(duì)H2O2的敏感性降低。以上結(jié)果

8、表明超表達(dá)ZmLTPL63可以通過(guò)提高植株抗氧化能力來(lái)增加對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性。
　?。?）在本生煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)ZmLTPL63，氣相色譜檢測(cè)表明葉片中不飽和脂肪酸如亞油酸、亞麻酸較對(duì)照明顯上升。說(shuō)明ZmLTPL63參與脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)。
　?。?）表達(dá)ZmLTPL63影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。轉(zhuǎn)基因擬南芥在生長(zhǎng)發(fā)育后期表現(xiàn)為抽苔和開花延遲。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與開花正向調(diào)控的關(guān)鍵基因的表達(dá)量明顯降低，推測(cè)ZmLTP