小果油茶種內(nèi)類型劃分、評(píng)價(jià)及親緣關(guān)系研究.pdf

1、小果油茶（Camellia meiocarpa Hu.）是我國(guó)栽培面積和年產(chǎn)量?jī)H次于普通油茶的油料樹種，但對(duì)其遺傳改良研究仍處于初級(jí)階段。小果油茶為異花授粉植物，種內(nèi)變異類型極為豐富。為充分挖掘和利用現(xiàn)有的遺傳變異，本文在前期充分調(diào)查的基礎(chǔ)上，對(duì)小果油茶種內(nèi)自然變異類型進(jìn)行了劃分，同時(shí)針對(duì)小果油茶分類地位仍存在異議的問(wèn)題，從孢粉學(xué)、表型、基因組DNA和基因轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)典型小果油茶類型的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究。主要結(jié)論如下:
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2、.根據(jù)小果油茶生物學(xué)特性及種群遺傳特點(diǎn)，結(jié)合前期的調(diào)查資料，初步對(duì)小果油茶種內(nèi)變異類型進(jìn)行了劃分。結(jié)果表明:小果油茶樹體、果實(shí)、葉片、花等表型性狀變異十分豐富，其中樹體性狀的變異系數(shù)最大（平均CV=43.79％），其次是果實(shí)性狀（平均CV為26.09％），葉和花性狀的變異系數(shù)相對(duì)較小，平均為16.84％和16.53％。綜合R型聚類和主成分分析結(jié)果及成熟期等生態(tài)表現(xiàn)，提出以果實(shí)橫徑、果皮厚度和成熟期作為類型劃分的指標(biāo)，將小果油茶初步劃分為

3、10個(gè)類型。
　　 2.比較了部分典型小果油茶類型和普通油茶的花粉形態(tài)，并分析其與山茶屬物種間的親緣關(guān)系，結(jié)果表明:不同類型小果油茶的花粉均具有山茶屬植物花粉的種屬特征，即:花粉粒為長(zhǎng)形球、近球形，赤道面觀長(zhǎng)橢圓形，極面觀三裂圓形，具三孔溝，但花粉粒的外觀表面紋飾特征因不同類型而異。相關(guān)分析表明，不同小果油茶類型的單果質(zhì)量、鮮出籽率與花粉粒極軸長(zhǎng)（P值）呈顯著負(fù)相關(guān)，與溝間距離呈顯著正相關(guān)，因此可以通過(guò)花粉形態(tài)特征來(lái)鑒別小果油茶

4、類型。通過(guò)比較小果油茶和36個(gè)山茶物種間的花粉形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)小果油茶花粉大小與油茶組、紅山茶組的大部分種相似，而與連蕊茶組、短柱茶組、糙果茶組等大部分種相差甚遠(yuǎn)，初步說(shuō)明，小果油茶與油茶組和紅山茶組的大部分種有較近的親緣關(guān)系。
　　 3.對(duì)部分典型小果油茶類型和42個(gè)山茶屬油用類物種間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明:46個(gè)物種（類型）的表型性狀變異極為豐富，葉片、花、果實(shí)及其經(jīng)濟(jì)性狀等39個(gè)性狀的變異系數(shù)達(dá)4.95％～159.41

5、％，尤其是單果質(zhì)量和單果籽質(zhì)量的變異系數(shù)更是高達(dá)159.41％和134.72％;通過(guò)聚類分析將46個(gè)物種（類型）分為2大類群，其中小果油茶大果薄皮立冬籽（龍眼茶）、中果薄皮霜降籽（羊屎茶）、小果薄皮寒露籽（珍珠茶）和中果薄皮寒露籽（宜春白皮中籽）先與鈍葉短柱茶聚在一起，再與短柱茶、粉紅短柱茶、小果短柱茶、普通油茶等12個(gè)物種聚為一個(gè)亞類，說(shuō)明小果油茶的表型性狀和這些物種的表型性狀相似性較高。
　　 4、采用AFLP標(biāo)記對(duì)部分典型

6、小果油茶類型和42個(gè)山茶屬油用類物種間的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:18對(duì)AFLP引物組合共檢測(cè)到642條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶占95.69％;小果油茶羊屎茶與珍珠茶遺傳相似系數(shù)最大，為0.9539，越南油茶與滇北紅山茶遺傳相似系數(shù)最小(0.5272)。通過(guò)聚類分析將46個(gè)物種（類型）劃分為5個(gè)類群:越南油茶和小果短柱茶分別單獨(dú)為一類;糙果茶組聚為一類;14個(gè)紅山茶屬物種和短柱茶組中果實(shí)性狀較為類似的陜西短柱茶、攸縣油茶和閩鄂山茶聚為

7、一大類;小果油茶與除小果短柱茶外的油茶組、短柱茶組部分種聚為一類。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相比較，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記的聚類結(jié)果并不完全一致，但在一定程度上可以互補(bǔ)。
　　 5.以小果油茶和普通油茶的嫩葉及種仁為材料，建立了適合油茶的cDNA-AFLP反應(yīng)體系。結(jié)果表明:總RNA中分離的mRNA經(jīng)合成雙鏈cDNA后，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ在37℃下5h內(nèi)完全酶切，經(jīng)5U T4連接酶16℃連接的產(chǎn)物稀釋10倍后直接用于預(yù)擴(kuò)增;在20μL選

8、擇性擴(kuò)增體系中，以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍為模版、dNTP(10mM)1.5μL、引物(10μM)1.0μL、Taq酶用量1.25U時(shí)的擴(kuò)增效果較好。利用優(yōu)化體系成功篩選出61對(duì)可以獲得帶型豐富且重復(fù)性好的引物組合。
　　 6.為進(jìn)一步分析典型小果油茶類型間差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，本文嘗試用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)小果油茶基因表達(dá)差異進(jìn)行分析。138對(duì)引物組合共擴(kuò)增出3649條轉(zhuǎn)錄衍生片段(TDFs)，其中差異顯示的TDFs有3557個(gè)，

9、多態(tài)率高達(dá)97.48％。研究發(fā)現(xiàn)在大果薄皮立冬籽龍眼茶和普通油茶中特異表達(dá)的TDFs占總差異帶的4.27％，在龍眼茶和宜春白皮中籽中特異表達(dá)的TDFs占4.53％，在龍眼茶和羊屎茶中特異表達(dá)的TDFs有1.57％，在龍眼茶、羊屎茶和宜春白皮中籽中均特異表達(dá)的TDFs占1.88％，而在龍眼茶、宜春白皮中籽和普通油茶中均特異表達(dá)的TDFs占3.54％，說(shuō)明龍眼茶與普通油茶和宜春白皮中籽的親緣關(guān)系可能較近，而與羊屎茶的親緣關(guān)系可能相對(duì)較遠(yuǎn)?；?/p>

10、于TDFs表達(dá)模式差異的多態(tài)性將5個(gè)參試材料分為3類，其中龍眼茶和宜春白皮中籽聚為一類，羊屎茶和珍珠茶歸為一類，普通油茶獨(dú)立為一類，這與基因組DNA的AFLP分析結(jié)果一致。差異TDFs經(jīng)回收及測(cè)序，獲得了789個(gè)差異基因片段。經(jīng)BlastX/N同源性比對(duì)，有716個(gè)在GeneBank中找到了同源序列，其功能主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)合成、代謝、運(yùn)輸、細(xì)胞防御等方面。
　　 以上研究結(jié)果為小果油茶的分類、遺傳改良、種質(zhì)資源