精子預(yù)處理和母牛熱應(yīng)激對(duì)牛單性生殖胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)是充分利用雌性動(dòng)物繁殖性能、加快遺傳育種改良、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和研究胚胎早期發(fā)育機(jī)制的重要手段，主要包括體外受精(IVF)、精子卵胞質(zhì)內(nèi)注射(ICSI)、體細(xì)胞核移植以及單性生殖，即孤雌和孤雄生殖。單性生殖胚胎僅含有母源或父源遺傳物質(zhì)，已在模式動(dòng)物中用來(lái)研究基因組印記的發(fā)育調(diào)控機(jī)制、建立單性生殖胚胎干細(xì)胞系和生產(chǎn)基因修飾動(dòng)物。家畜孤雄生殖胚胎研究起步晚、生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜且效率低，已嚴(yán)重阻礙其作用的發(fā)揮。家畜精子在卵胞質(zhì)內(nèi)解聚能

2、力較差可能是影響孤雄生殖胚胎發(fā)育的關(guān)鍵原因之一。精子獲能、頂體反應(yīng)和精卵質(zhì)膜融合是自然受精前精子所經(jīng)歷的主要生理變化。因此，精子注射前進(jìn)行體外獲能、去除頂體和質(zhì)膜的預(yù)處理以模擬這些變化，可能會(huì)增強(qiáng)精子解聚能力從而提高牛孤雄生殖胚胎發(fā)育潛能。
　　 夏季高溫危害母牛體內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育，從而降低奶牛繁殖性能，并減弱卵母細(xì)胞及其IVF胚胎發(fā)育能力。因此，母牛熱應(yīng)激也可能對(duì)單性生殖胚胎發(fā)育造成影響。另外，此前研究多用季節(jié)反映母牛熱應(yīng)激對(duì)卵

3、母細(xì)胞質(zhì)量的影響，并不能確切、定量地描述環(huán)境熱應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的損害。溫濕指數(shù)(THI)作為衡量熱應(yīng)激程度的環(huán)境指標(biāo)已用于檢測(cè)熱應(yīng)激對(duì)奶牛產(chǎn)奶量和受胎率的影響。因此，用卵母細(xì)胞供體母牛所處環(huán)境的THI與卵母細(xì)胞質(zhì)量和后期發(fā)育聯(lián)系起來(lái)，其結(jié)果更具可比性和參照性。據(jù)報(bào)道甜菜堿能幫助微生物、植物和家禽抵抗熱應(yīng)激，尚不清楚甜菜堿對(duì)哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞的影響。為利用甜菜堿降低母牛熱應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育能力的負(fù)面影響，須先在牛體外細(xì)胞模型中鑒定其

4、抗熱應(yīng)激功能。圍繞上述問(wèn)題，本文做了以下四個(gè)方面的研究。
　　 1.精子預(yù)處理對(duì)牛精子頂體及質(zhì)膜的影響
　　 本研究目標(biāo)為篩選高效、安全的去除牛精子頂體和質(zhì)膜方法，初步分析其對(duì)精子解聚潛力的影響，并探討精子獲能在其中發(fā)揮的作用。首先利用花生凝集素(FITC-PNA)和麥胚凝集素(FITC-WGA)分別標(biāo)記了牛精子頂體和質(zhì)膜，定量分析了鈣離子載體(CaA23187)、曲通-100(TX-100)和溶血卵磷脂(LL)三種不同

5、頂體和質(zhì)膜去除劑以及去除前是否獲能對(duì)精子頂體和質(zhì)膜狀態(tài)的影響。通過(guò)細(xì)胞死活檢測(cè)和吖啶橙染色，評(píng)定了頂體和質(zhì)膜處理對(duì)精子活力和染色質(zhì)完整性的影響。最后，在未使用卵母細(xì)胞的前提下，利用二硫蘇糖醇(DTT)檢測(cè)了牛精子獲能和/或項(xiàng)體、質(zhì)膜去除后的解聚潛能。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)TX-100（61.53±2.06％）和LL(51.87±2.53％)組精子的頂體去除率均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照（25.81±2.99％）和Ca

6、A23187（33.10±4.73％）。LL組精子質(zhì)膜去除率（62.89±1.72％）顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組(10.38±1.99％)、CaA23187組（30.13±1.72％）和TX-100組（33.00±1.99％）。與體外獲能處理聯(lián)合，能進(jìn)一步提高(P＜0.05)頂體和質(zhì)膜的移除效率。
　　 (2)去除精子頂體和質(zhì)膜雖導(dǎo)致精子活力從35.7％（對(duì)照組）下降至0～21.5％，但不會(huì)影響精子染色質(zhì)完整性。
　　

7、 (3)與對(duì)照比，TX-100和LL處理組顯著降低了對(duì)DTT誘導(dǎo)解聚不敏感的精子所占比例(6.11±1.00％vs.20.30±0.93％，P＜0.05;3.51±0.82％vs.20.30±0.93％，P＜0.05)。若將精子獲能與LL處理相結(jié)合可顯著增加高度解聚精子所占比例（54.60±1.98％vs.15.62±1.61，P＜0.05）。
　　 2.精子獲能聯(lián)合頂體和質(zhì)膜去除對(duì)牛孤雄胚胎發(fā)育的影響
　　 本研究目

8、的是以牛精子克隆孤雄(SpC-AG)胚胎為載體，進(jìn)一步比較和分析精子獲能以及去除頂體和質(zhì)膜的預(yù)處理方法對(duì)精子在卵胞質(zhì)內(nèi)的解聚能力、解聚同步性、以及孤雄胚胎發(fā)育潛能的影響。構(gòu)建的SpC-AG胚胎根據(jù)注射前的精子預(yù)處理方法分組，即獲能(CM)、TX-100、LL、獲能后TX-100處理(CM+TX-100)、獲能后LL處理(CM+LL)以及空白對(duì)照。首先，利用熒光染色的方法觀察了各組胚胎內(nèi)精子的解聚情況，并比較了各組胚胎的體外發(fā)育能力。其次

9、，取各組中已卵裂但不能發(fā)育至囊胚的胚胎進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)觀察，檢測(cè)胚胎內(nèi)核質(zhì)發(fā)育的同步性。最后，將實(shí)驗(yàn)中得到的桑葚胚和囊胚移植入代孕母牛，以觀察其植入后發(fā)育能力。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)LL預(yù)處理精子顯著提高了構(gòu)建的SpC-AG胚胎內(nèi)兩個(gè)精子同步解聚率(51.1％vs.23.3％，P＜0.05)。注射兩個(gè)CM+LL精子具有最高的精子同步解聚率(72.2％)和原核形成率(46.3％)。這表明精子注射前去除項(xiàng)體和質(zhì)膜可增強(qiáng)其在S

10、pC-AG胚胎的解聚能力，而獲能可能對(duì)精子在卵胞質(zhì)內(nèi)的染色質(zhì)重構(gòu)有促進(jìn)作用。
　　 (2)首次得到發(fā)育至囊胚期的牛精子克隆孤雄胚胎。TX-100或LL去除頂體和質(zhì)膜能顯著(P＜0.05)降低注射后胞質(zhì)碎裂發(fā)生頻率。LL組SpC-AG胚胎的8-細(xì)胞發(fā)育率、桑葚胚和囊胚發(fā)育率均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組。CM、CM+TX-100和CM+LL處理都能顯著(P＜0.05)提高SpC-AG囊胚生產(chǎn)效率。
　　 (3)LL處理精

11、子顯著提高了卵裂的SpC-AG胚胎內(nèi)核質(zhì)同步發(fā)育能力（64.1％vs.19.7％，P＜0.001），同時(shí)卵裂球內(nèi)精子未解聚的情況顯著減少(10.9％vs.47.5％,P＜0.001)。
　　 (4)SpC-AG胚胎移植后沒(méi)有觀察到母牛發(fā)生妊娠，但代孕母牛返情期被延長(zhǎng)，暗示胚胎可能在妊娠早期丟失。
　　 3.母牛熱應(yīng)激對(duì)牛單性生殖胚胎發(fā)育的影響
　　 為檢測(cè)母牛熱應(yīng)激對(duì)牛單性生殖胚胎發(fā)育是否有影響，本研究以THI為

12、衡量熱應(yīng)激指示信號(hào)，并將卵母細(xì)胞供體母牛所受熱應(yīng)激分為無(wú)熱應(yīng)激(THI＜72)、輕度熱應(yīng)激(72≤THI＜80)和中高度熱應(yīng)激(THI≥80)三個(gè)程度，分析了母牛熱應(yīng)激對(duì)共計(jì)2585枚卵母細(xì)胞體外成熟率以及2807枚ICSI、孤雌和孤雄生殖胚胎發(fā)育能力的影響，并探討了母牛熱應(yīng)激與卵母細(xì)胞成熟率以及三類胚胎發(fā)育率的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時(shí)的THI對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟率有影響(P＜0.05)，且兩

13、者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.37)。輕度熱應(yīng)激(72≤THI＜80)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟率沒(méi)有影響，但中高度熱應(yīng)激組(THI≥80)成熟率顯著降低(52.1±2.9％vs63.2±2.3％,P＜0.01)。
　　 (2)供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時(shí)的THI對(duì)后續(xù)生產(chǎn)的ICSI胚胎的卵裂率(P＜0.01)、4-8細(xì)胞發(fā)育率(P＜0.001)和≥16細(xì)胞發(fā)育率(P＜0.05)有影響，且與后兩者存在負(fù)相關(guān)（r=-0.52和-0.40）。中高度熱應(yīng)激

14、(THI≥80)組胚胎各階段發(fā)育率均顯著降低(P＜0.05)。
　　 (3)未檢測(cè)到供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時(shí)的THI對(duì)孤雌胚胎卵裂率有影響，但對(duì)其4-8細(xì)胞發(fā)育率(P＜0.01)和≥16發(fā)育率(P＜0.05)有影響，且均存在負(fù)相關(guān)（r=-0.41和-0.45）。THI≥72時(shí)，孤雌胚胎4-8細(xì)胞發(fā)育率均顯著(P＜0.05)低于THI＜72時(shí)的發(fā)育情況。THI≥80時(shí)，孤雌胚胎4-8細(xì)胞發(fā)育率和≥16細(xì)胞發(fā)育率均顯著低于THI＜72

15、。
　　 (4)未檢測(cè)到供體母牛體內(nèi)卵泡發(fā)育時(shí)的THI對(duì)孤雄胚胎發(fā)育能力的影響。
　　 4.甜菜堿的抗熱應(yīng)激生理功能研究
　　 本研究旨在以三維立體培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為體外模型，探究甜菜堿是否能幫助哺乳動(dòng)物細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激不良影響。利用實(shí)時(shí)定量PCR、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)和3，3'-[1-(苯氨?；?-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉(XTT)檢測(cè)分別調(diào)查分析了

16、正常和熱應(yīng)激條件下，甜菜堿對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞熱休克蛋白(HSP)表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力的影響，論證了甜菜堿協(xié)助哺乳動(dòng)物細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激損傷的生理作用，為將其應(yīng)用于降低母牛熱應(yīng)激的負(fù)面影響提供了理論支撐。主要結(jié)果如下:
　　 (1)熱應(yīng)激條件下，甜菜堿維持了細(xì)胞基本形態(tài)，顯著降低了細(xì)胞凋亡率(P＜0.0001)并提高了細(xì)胞活力(P＜0.05)。
　　 (2)熱應(yīng)激條件下，甜菜堿維持了細(xì)胞表達(dá)HSP70和HSP27的能力

17、。
　　 (3)正常條件下，甜菜堿降低了細(xì)胞HSP需要量并加快了細(xì)胞增殖率。
　　 本文得出的主要結(jié)論為:獲能與溶血卵磷脂聯(lián)合處理能高效地去除牛精子頂體和質(zhì)膜，并增強(qiáng)了精子在卵胞質(zhì)內(nèi)的解聚能力、提高了牛孤雄生殖胚胎發(fā)育能力;供體母牛卵泡發(fā)生時(shí)所處環(huán)境的THI可作為母牛熱應(yīng)激的指示信號(hào)，母牛熱應(yīng)激降低了牛ICSI和孤雌生殖胚胎發(fā)育能力;甜菜堿減弱了熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活力和熱休克蛋白表達(dá)能力下降等負(fù)面影