池蝶蚌親環(huán)蛋白的分子特征和功能研究.pdf

1、池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）產(chǎn)于日本滋賀縣的琵琶湖，比其它淡水珍珠蚌具有更好的抗病能力。本研究以淡水貝池蝶蚌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象采用RACE PCR方法獲得了其親環(huán)素蛋白家族（Cyps）中CyPD、CyPC和CyPH的cDNA基因全長(zhǎng)：池蝶蚌CyPD基因cDNA（Gen Bank注冊(cè)號(hào)：KJ747387。）全長(zhǎng)為2671bp，5’-非翻譯區(qū)（Untranslated Region,UTR)80bp，其中3’-UTR1487b

2、p包括一個(gè)多聚腺苷信號(hào)AAATAA和Poly(A)尾巴，1104bp的開放性閱讀框（Open reading frame，ORF）編碼367個(gè)氨基酸，分子量約為41.09kDa，理論等電點(diǎn)pI=5.43；池蝶蚌CyPC基因cDNA全長(zhǎng)為2050bp，5’-UTR89bp，其中3’-UTR500bp包括一個(gè)多聚腺苷信號(hào)AAAATAA和Poly(A)尾巴，1461bp的ORF編碼486個(gè)氨基酸，分子量約為55.93kDa，理論等電點(diǎn)pI=6

3、.07；池蝶蚌CyPH基因cDNA（Gen Bank注冊(cè)號(hào)為KJ747386。）全長(zhǎng)為761bp，5’-UTR70bp，其中3’-UTR151bp包括一個(gè)多聚腺苷信號(hào)AAAATAA和Poly(A)尾巴，ORF540bp編碼179個(gè)氨基酸，分子量約為19.66kDa，理論等電點(diǎn)pI=7.60。生物信息學(xué)分析表明，CyPD、CyPC和CyPH具有典型的親環(huán)素肽酰脯氨酸順反異構(gòu)酶蛋白功能域，同時(shí)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明在進(jìn)化地位上也相當(dāng)保守。

4、r>　　用CyPB基因完整的ORF與pET-32a構(gòu)建pET-32a-CyPB重組表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌BL21（DE3）中進(jìn)行原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IPTG成功誘導(dǎo)了分子量約為40kDa的HsCyPB蛋白；結(jié)果還顯示蛋白主要存在于上清中，因而利用鎳離子親和層析法純化上清獲得單一的融合蛋白。
　　純化的HsCyPB作為抗原免疫日本大白兔制備的多克隆抗體，抗體的效價(jià)高達(dá)1:512000，說明獲得效價(jià)很高的抗體，而且Western b

5、lot檢測(cè)結(jié)果表明制備的多克隆抗體具有很好的特異性；利用HsCyPB的抗體對(duì)池蝶蚌肝臟冰凍切片進(jìn)行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)HsCyPB蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上都有表達(dá)。
　　熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)CyPA、CyPB在池蝶蚌的八個(gè)組織中均有表達(dá)，并且在肝臟中表達(dá)量最高，其次是在腸和性腺，血中的表達(dá)量最低；根據(jù)池蝶蚌CyPA、CyPB基因的cDNA全長(zhǎng)序列，構(gòu)建含有完整開放閱讀框(ORF)的pEGFP-C1-CyPA、pEGFP-C1-CyP

6、B表達(dá)載體；在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過程中，人肝癌細(xì)胞（HePG2）作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，pEGFP-C1質(zhì)粒作為對(duì)照組A，pEGFP-C1-CyPA作為實(shí)驗(yàn)組B，pEGFP-C1-CyPB作為實(shí)驗(yàn)組C，pEGFP-C1-CyPA＋pEGFP-C1-CyPB作為實(shí)驗(yàn)組D，利用轉(zhuǎn)染試劑將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞（HePG2）中進(jìn)行真核表達(dá)，細(xì)胞在培養(yǎng)36h后在共聚焦顯微鏡中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的熒光明顯比對(duì)照組多，同時(shí)在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組額熒光比對(duì)