池蝶蚌脂多糖誘導的腫瘤壞死因子(HsLITAF)的分子結構特征和功能分析.pdf

1、脂多糖誘導的腫瘤壞死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor，LITAF)可以調(diào)控TNF-α、IL-2等細胞因子，在無脊椎動物的先天性免疫系統(tǒng)中扮演著重要的介質(zhì)作用。本研究根據(jù)池蝶蚌LITAF（以下簡稱HsLITAF）基因家族的部分EST序列，應用RACE-PCR技術獲得3個池蝶蚌LITAF基因的cDNA全長序列，分別命名為HsLITAF1、HsLITAF2、HsLITAF3,它們的c

2、DNA全長分別為720bp，1115bp和688bp，分別可以編碼146，163和115個氨基酸的蛋白質(zhì)，對應的理論分子量為16.17，17.41和12.48KDa。分析發(fā)現(xiàn)，HsLITAFs與其它物種之間的LITAF蛋白存在著31％～94%不等的同源性和48%～100%的相似性。除HsLITAF3外其它兩個亞型均有兩個保守的CXXC基序；系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)HsLITAF1與HsLITAF3發(fā)生了輕微的分化，與蝦夷扇貝的LITAF蛋白聚

3、為一類；HsLITAF2和櫛孔扇貝、太平洋牡蠣的LITAF蛋白聚為一群，之后再與HsLITAF1和HsLITAF3聚在軟體動物一支。
　　Realtime-PCR檢測3個基因的組織分布發(fā)現(xiàn)，三者呈現(xiàn)了不同的組織表達差異性，HsLITAF1和HsLITAF3在肝胰腺中表達量最高，HsLITAF2在鰓中表達量最高，但一致的是它們在血細胞中的表達量都是最低的。通過閉殼肌注射LPS觀察3h、6h、12h、24h、48h不同時間段血細胞中的

4、應答情況發(fā)現(xiàn)，3個HsLITAF基因在3h以后都發(fā)現(xiàn)了顯著的上調(diào)，HsLITAF1和HsLITAF3在24h后表達量達到最大值，HsLITAF2在48h后達到最值。這說明HsLITAFs參與了池蝶蚌對LPS的免疫應答。
　　CCK8檢測細胞體外增殖實驗表明HsLITAF1、HsLITAF2、HsLITAF3基因不同程度的抑制了細胞的體外增殖，轉染3個基因之后的細胞增值率分別是空白組的71.46%，72.20%，77.06%。流式細

5、胞計數(shù)分析顯示，3個基因均不同程度的誘發(fā)了SMCC-7721的凋亡，分別達到46%，24.84%和12.84%。Realtime-PCR檢測HsLITAF1-3實驗組細胞凋亡相關基因，結果顯示Bax基因分別上調(diào)1.43、1.41、1.29倍；Bcl-2基因分別下調(diào)到0.33倍，0.32倍，0.59倍；Caspase3基因分別上調(diào)1.80倍，3.05倍，1.40倍；P53基因分別上調(diào)7.04倍，7.92倍和3.10倍。這說明HsLITAF

6、s可能是通過調(diào)控這些凋亡相關基因的表達誘導SMCC-7721細胞的凋亡。
　　對3個HsLITAF的亞細胞定位進行生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，HsLITAF1定位于細胞核中可能性最高為69.6%；HsLITAF2定位于細胞核中可能性最高為38.4%；HsLITAF3定位于細胞核中可能性最高為69.6%。進行試驗驗證發(fā)現(xiàn)HsLITAF1和HsLITAF2在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，且主要在細胞核中有表達，但是HsLITAF3只在細胞質(zhì)中有表

7、達，這說明生物信息學的預測有一定的準確性，HsLITAF3不能進入細胞核可能與其丟失了C端的CXXC結構有關，并且可能由此引發(fā)了HsLITAF3與HsLITAF1在功能上的差異化。
　　總之，HsLITAFs參與了池蝶蚌的先天免疫應答，在組織中呈現(xiàn)應答差異化；HsLITAFs可以調(diào)節(jié)P53，Bax，caspase3，Bcl2等基因表達不同程度的誘導SMCC-7721細胞的凋亡。HsLITAF3在丟失了CXXC結構域后無法入核，可能