環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)對人工繁殖南方鲇的雌性化作用.pdf

1、南方鲇(Silurus meridionalis，Chen)廣泛分布于長江流域，是近年來開發(fā)的名特優(yōu)養(yǎng)殖新品種;并且西南大學(xué)在南方鲇的移養(yǎng)、馴化和人工繁殖上進(jìn)行了開創(chuàng)性工作。在野生條件下，雌雄比列約為1∶1;而人工繁殖的南方鲇卻為全雌。為找到其雌化的原因，本實驗室開展了十余年的研究。其性腺分化發(fā)生在孵化后7天左右，并且卵巢和精巢中的生殖細(xì)胞分別在55和135dah左右進(jìn)入減數(shù)分裂。前期通過對水質(zhì)，光照，不同的人工授精方法、孵化溫度、孵化

2、后養(yǎng)殖溫度和餌料的研究，初步證明開口餌料水蚯蚓可能是引起人工繁殖南方鲇全雌化的主要原因。但仍有許多問題有待闡明，比如，投喂水蚯蚓多久可以引起全雌化？水蚯蚓誘導(dǎo)全雌化的根本原因是什么？全雌化的機(jī)制是什么？魚類性別與減數(shù)分裂起始的時間有關(guān)，投喂水蚯蚓是否會影響南方鲇減數(shù)分裂的起始時間？圍繞上述問題，本論文主要開展了以下研究:
　　為找到水蚯蚓投喂時間與雌性化的關(guān)系，本研究將孵化的魚苗分為五組，分別投喂水蚯蚓0（對照組）、5、10、30

3、和90天，商業(yè)餌料投喂至3月齡;以投喂0天為對照組;性腺組織學(xué)檢測表明，投喂水蚯蚓5天，雌魚所占的比例為73％，投喂水蚯蚓10，30和90天雌魚所占的比例均為100％。而對照組雌、雄性比約為1∶1。以上結(jié)果初步說明人工繁殖南方鲇全雌化是由于早期投喂水蚯蚓所致，水蚯蚓影響性別的關(guān)鍵時期是在孵化后5-10天，這與南方鲇性別決定和分化的關(guān)鍵時期一致。
　　為找到水蚯蚓誘導(dǎo)南方鲇人工繁殖全雌化的真正原因，課題組從嘉陵江3個不同的小溪中分別

4、采集水蚯蚓，樣品經(jīng)過前處理之后，利用高效液相色譜法檢測水蚯蚓體內(nèi)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(EDCs)，結(jié)果表明，水蚯蚓體內(nèi)含有雙酚A、己烯雌酚、辛基酚和壬基酚。并且在3個采樣點(diǎn)，壬基酚的平均含量最高。為進(jìn)一步驗證這4種EDCs，利用半制備高效液相分別進(jìn)行收集，經(jīng)過純度分析后，通過質(zhì)譜對其進(jìn)行初步定性，結(jié)果表明，這四種物質(zhì)確為雙酚A、己烯雌酚、辛基酚和壬基酚。
　　為進(jìn)一步驗證水蚯蚓在南方鲇全雌化過程中的作用，本研究分別設(shè)計不同的餌料實

5、驗組:(1)投喂高溫滅活的水蚯蚓;(2)含有EDCs cooktail的商業(yè)餌料;(3)魚苗自孵化后一直投喂正常商業(yè)餌料（對照組）。孵化后90天解剖取出性腺，肉眼觀察初步判定雌雄;同時，性腺用波恩氏液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、顯微觀察，進(jìn)一步核實性別，并統(tǒng)計性比。結(jié)果顯示:投喂高溫滅活水蚯蚓組和噴灑EDCs cooktail（雙酚A、己烯雌酚、辛基酚和壬基酚的混合物）的商業(yè)餌料組的實驗魚為全雌;因此，水蚯蚓體內(nèi)的EDCs是誘導(dǎo)

6、人工繁殖南方鲇全雌化的主要原因。
　　對已知的與性別決定分化相關(guān)基因在1齡轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在魚類性別決定和分化過程中起關(guān)鍵作用且在雌性表達(dá)高的Foxl2和在雄性表達(dá)高的Dmrt1、Sf1和Wt1在1齡南方鲇性腺中仍然有表達(dá)，且此時它們在雌、雄性腺的表達(dá)模式與其在性別決定分化時期在性腺的表達(dá)模式一致，說明這些基因不僅參與了魚類的性別決定與分化，而且對性腺的發(fā)育和維持也具有重要作用。通過Real time PCR檢

7、測了性別決定關(guān)鍵基因Dmrt1、Sf1、Foxl2和Cyp19a1a在南方鲇雌性化過程中的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示:在孵化后30天和90天，F(xiàn)oxl2和Cyp19a1a在卵巢中是高表達(dá)的，在精巢中的表達(dá)量很低;而Dmrt1和Sf1在精巢中高表達(dá)，在卵巢中低表達(dá);并且這4個基因在投喂水蚯蚓的南方鲇性腺中的表達(dá)模式與其在正常卵巢中表達(dá)模式是一致的。因此，南方鲇性別分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及Cyp19a1a的表達(dá)在投喂水蚯蚓后都受到了影響，最終導(dǎo)致C

8、yp19a1a高表達(dá)。與此相吻合，對3月齡南方鲇血清中雌、雄激素和卵黃蛋白原水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，投喂水蚯蚓的南方鲇血清中含有高水平的E2和卵黃蛋白原以及低水平的11-KT，這與正常雌魚血清中這三種物質(zhì)的表達(dá)水平類似。以上結(jié)果表明，南方鲇性別分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及Cyp19 a1a的表達(dá)模式在投喂水蚯蚓后發(fā)生了變化，最終導(dǎo)致Cyp19a1a高表達(dá)，使雌激素維持在高水平，從而產(chǎn)生全雌化現(xiàn)象。
　　本研究通過Real-time PCR

9、檢測Stra8的表達(dá)，結(jié)果表明，RA信號通路關(guān)鍵因子Stra8在50 dah卵巢和130 dah精巢中表達(dá)量最高，60 dah卵巢和150dah精巢表達(dá)量開始急劇降低。細(xì)胞表達(dá)模式研究表明Stra8特異表達(dá)于性腺的生殖細(xì)胞中，而且在50 dah卵巢和130 dah精巢中檢測到的信號最強(qiáng)，60 dah卵巢和150dah精巢中檢測到的信號較弱。這些數(shù)據(jù)初步表明，Stra8可能與減數(shù)分裂起始有密切聯(lián)系。利用RA浸浴南方鲇后，Real-time

10、 PCR和免疫組化檢測Stra8的表達(dá)，結(jié)果均顯示，RA可以上調(diào)Stra8的表達(dá)，表明RA信號通路在脊椎動物減數(shù)分裂起始過程中的作用可能是相對保守的。通過免疫組化檢測正常精、卵巢和投喂水蚯蚓的南方鲇性腺中Stra8的表達(dá)表明，水蚯蚓投喂組性腺中Stra8的信號強(qiáng)度與其在正常卵巢中信號強(qiáng)度一致，而在正常精巢中幾乎沒有檢測到Stra8陽性信號。因此，在投喂水蚯蚓的南方鲇中，EDCs可能是通過影響Stra8的表達(dá)來控制減數(shù)分裂的起始時間，從而

11、引起南方鲇的全雌化。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明，南方鲇人工繁殖全雌化是由于在性別決定的關(guān)鍵時期投喂水蚯蚓所致，并且水蚯蚓體內(nèi)富集的EDCs是引起全雌化的主要原因，這些EDCs可能通過影響性別決定與分化關(guān)鍵基因Dmrt1、Sf1、Foxl2和Cyp19a1a和減數(shù)分裂起始關(guān)鍵基因Stra8的表達(dá)模式，使南方鲇內(nèi)源雌激素水平升高，減數(shù)分裂起始時間提前，最終導(dǎo)致南方鲇的全雌化。本研究首次提出投喂一種活的生物餌料可以引起魚類的雌性化。