鹽脅迫下誘抗劑對水稻P450基因的擴增多態(tài)性分析.pdf

1、在誘抗劑HI能夠提高水稻R6耐鹽能力的基礎上，本實驗針對水稻R6誘導耐鹽相關基因P450作為研究的目標基因，通過“功能基因擴增多態(tài)性”(FGAP)標記方法，分析基因組DNA與轉(zhuǎn)錄后基因表達(cDNA序列)的多態(tài)性，并對特殊的條譜進行凝膠回收測序，分析其特異性。實驗主要結(jié)果如下： 1.藥物處理下的水稻形態(tài)表現(xiàn) 與H2O對照相比，鹽脅迫下水稻的根長受到了明顯的抑制，根色發(fā)黃，短而粗，苗高比親本要矮小。與1％NaCl脅迫相比，

2、經(jīng)過誘抗劑HI預處理后，根長得到了誘導，根色變白，比水的粗比鹽的細，苗高分別介于同一類型植株H2O和鹽處理之間。與鹽脅迫對照相比，紅霉素、西咪替丁抑制苗高和根長，利福平促進苗高抑制根長，環(huán)孢素A促進根長且幼苗比鹽處理稍高。 2.采用六種方法提取DNA，結(jié)果顯示液氮研磨法、SDS法、CTAB法所得的基因組DNA效果較好，但在DNA濃度上明顯小于優(yōu)化SDS法；優(yōu)化CTAB法所提取的基因組DNA雖然濃度較大，但純度較差，拖尾較嚴重；試

3、劑盒提取得到的基因組DNA純度高，DNA量也很充足，并且沒有RNA污染。 3.不同處理的P450基因cDNA序列多態(tài)性分析 3.1反應體系的優(yōu)化結(jié)果。本文改良了陳曉[79]的反轉(zhuǎn)錄體系，將Oligodt引物量由2μl改為1μl，同時在反應條件中增加了25℃溫浴10min后再進行42℃的恒溫反應，得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更為完整，actin引物檢測時得到的特異條帶更亮更集中。針對cDNA的PCR反應體系特點，進一步改良了朱志凱[7

4、4]和陳曉[79]的PCR反應體系，根據(jù)條帶重新優(yōu)化體系，包括反應體系的成分用量以及反應條件。最終優(yōu)化PCR反應體系：20μl PCR反應體系中，含60ng模板cDNA，1μl20mM dNTP，0.5 U TaqDNA聚合酶，2.5μl10pM隨機引物和3.5μL10pM特異引物，復合退火溫度為隨機引物35℃，特異引物55℃。 3.2對目的基因的退火溫度及循環(huán)數(shù)的篩選，T2、T7、T15、P7、P8、P9、P11、P15的最佳

5、退火溫度分別為58℃、55℃、55℃、58℃、55℃、58℃、58℃、58℃，最佳循環(huán)次數(shù)分別為34、32、32、34、34、36、34、32。 3.3篩選引物組合。篩選與光合速率顯著相關的組合進行基因組以及cDNA序列多態(tài)性檢測，共篩選出30對引物組合，分別對水稻R6三種處理(清水、鹽及HI)條件下提取的DNA進行擴增及RNA進行RT-PCR擴增，產(chǎn)生多態(tài)性條帶242條，多態(tài)性達75％，大多數(shù)條帶集中在100-600bp。

6、 3.4聚丙烯酰胺凝膠電泳回收。改進了聚丙烯酰胺凝膠回收的方法，將煮沸法融合到一步法中，用特異引物T7和T2擴增，得到了158bp和226bp兩條清晰條帶。 4.在鹽脅迫條件下CsA誘導水稻NM001066006基因發(fā)生選擇性剪接。本實驗首次發(fā)現(xiàn)用一種功能基因擴增多態(tài)性(Functional Genes Amplified Polymorphism，F(xiàn)GAP)方法中的組合引物對P3P2，進行cDNA序列擴增，在CsA作用下，

7、簡便有效地區(qū)分NM_001066006和NM_001066009的表達，并對圖11，12中約530 bp條帶是在NM_001066006中處于195 bp內(nèi)含子，而在NM_001066009中卻處于102 bp外顯子作出合理的解釋，可見水稻P450基因?qū)λ幬顲sA有明顯作用，因而在水稻中利用CsA研究P450基因、MDR基因與抗逆性的相互作用值得深入探討。而FGAP為mRNA選擇性剪接的研究提供了一個簡便有效方法。 5.對194

8、50基因特異條帶回收測序分析?；厥諚l帶進行PCR擴增，由上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果顯示，用H2O、S、HI處理后，不同處理的cDNA序列與NM_190966相同的堿基占70％；在NM_190966基因編碼序列1042bp處，清水和HI處理的水稻R6材料發(fā)生了一個堿基的缺失；在NM_190966基因編碼序982-1458處，水稻R6材料發(fā)生了65個堿基變異，其中AC1079CA明顯是顛換的結(jié)果；但有8個堿基是在鹽脅迫下發(fā)生改變