白葉枯病菌hrpX-hrpG雙基因敲除突變體的構(gòu)建及特性研究.pdf

1、由水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的水稻白葉枯病是水稻最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，研究表明，盡管不同細(xì)菌使用特有的方式侵入寄主，但有一種機(jī)制是相同的，即植物病原細(xì)菌通過III型分泌系統(tǒng)(type III secretionsystem，T3SS)將致病性效應(yīng)子注入植物細(xì)胞中從而導(dǎo)致寄主植物抗感病和非寄主植物的過敏反應(yīng)。植物病原細(xì)菌的III型分泌系統(tǒng)是由hrp基因編碼的，鑒定編碼T3SS效應(yīng)子

2、的基因是了解III型分泌系統(tǒng)在植物致病性的作用的重要一步，在黃單胞菌中，表達(dá)T3SS的結(jié)構(gòu)基因和一些效應(yīng)子基因都是被hrpG和hrpX基因產(chǎn)物所調(diào)節(jié)，在Xoo、Xac和Xcc中都是如此。Xoo中的hrpB-hrpF操縱元可被hrpX調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物活化，HrpX可通過含PIP(plant induceable promoter)框(TTCGC-N15-TTCGC)的啟動子活化hrp基因或其它毒性基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而hrpX調(diào)節(jié)基因和hrpA操縱

3、元的表達(dá)是受hrpG調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物調(diào)控的，并且hrpX和hrpG這兩個調(diào)節(jié)基因獨(dú)立于hrp基因簇外，相鄰排列，轉(zhuǎn)錄方向相反。兩基因起始密碼子間間隔有非編碼序列，包含了這兩個基因各自的啟動子序列。 本研究根據(jù)XoohrpX/hrpG基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計引物，從Xoo中克隆了hrpX/hrpG基因。利用敲除載體pKNG101，成功構(gòu)建pKNG-△hrpX/△hrpG基因置換型載體，轉(zhuǎn)化Xoo，通過兩側(cè)同源序列雙交換，得到Xoo△hrpX/

4、△hrpG中間插入Kan片段的突變體，致病性檢測發(fā)現(xiàn)，突變體的致病力較野生型菌株明顯減弱，說明hrpX/hrpG在致病性中起到重要的作用。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體菌株較野生型菌株表面有數(shù)量不等的突起出現(xiàn)。結(jié)合基因芯片技術(shù)，噴霧接種Xoo野生型菌株JxoI、細(xì)條斑病菌RS63、非寄主菌Xv5、突變體菌株及清水對照，24小時后取材，凍存，提取總RNA。在檢測的57259個基因中，得到大量的上調(diào)與下調(diào)基因，其中接種突變體菌株與清水對照比較上調(diào)基因