榨菜和紫甘藍嫁接嵌合體生長發(fā)育特性與不定器官起源的研究.pdf

1、榨菜(Brassica juncea Coss.var.tumida Tsen et Lee)和紫甘藍(B.oleracea var.capitata L.)屬于十字花科蕓薹屬植物，是重要的蔬菜作物。以榨菜和紫甘藍為材料通過試管離體嫁接可以獲得種間嵌合體。本論文以榨菜和紫甘藍種間嵌合體為研究材料，通過植物學、細胞學、生物化學、分子生物學等方法，研究了嵌合體營養(yǎng)時期和生殖時期生長發(fā)育特性；通過嵌合體光合特性研究，探討嫁接“優(yōu)勢”與兩種遺傳

2、型的細胞系之間的相互關系；通過嵌合體不同部位的不定器官再生研究，揭示了植物不定器官的起源和發(fā)生規(guī)律，以及不同細胞層間的相互影響。本研究為植物育種學和植物發(fā)育學研究提供了新思路和新方法，為細胞互作機制研究提供了良好的試驗體系，也為利用嵌合體改良植物性狀以及生產(chǎn)實踐應用提供理論依據(jù)，主要研究結果如下： 1.在形態(tài)學、細胞水平、蛋白質(zhì)水平和分子水平上對榨菜和紫甘藍的種間嵌合體進行了分析。研究結果發(fā)現(xiàn)嵌合體的形態(tài)特征在具有了兩個親本特點

3、的基礎上，其形態(tài)發(fā)生了一定變化。利用掃描和透射電鏡觀察葉片表皮和葉肉細胞亞顯微結構，發(fā)現(xiàn)嵌合體的氣孔密度超過兩個親本，葉綠體、淀粉粒等的形態(tài)指標基本處于兩個親本之間。通過可溶性蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜觀察到嵌合體產(chǎn)生了特異性條帶。分子水平上的RAPD和特異引物PCR擴增結果顯示，嵌合體沒有產(chǎn)生其特異性條帶。這些研究結果證明嵌合體中兩種基因型不同的細胞系之間存在著相互作用，使嵌合體在形態(tài)學、細胞學和生物化學特性發(fā)生了改變。另外，嵌

4、合體采用離體保存的方法，用1/2MS培養(yǎng)基可以長期保存。利用腋芽繁殖途徑對嵌合體進行無性繁殖，這種方法可以使后代植株保持與母株一樣的嵌合狀態(tài)。用1/2MS+1mg/LBA培養(yǎng)基擴繁時，周緣嵌合體轉化為扇形嵌合體和混合型嵌合體的比例分別是8.2％和2.4％。而用1/2MS+0.1mg/LBA時周緣嵌合體基本不會產(chǎn)生其它類型的嵌合體，但腋芽生長速度較慢。田間植株腋芽離體繁殖所用的誘導培養(yǎng)基為1/2MS+1mg/LBA，但腋芽的誘導率比試管苗

5、低. 2.從光合作用、葉綠素熒光、葉綠素含量、Rubisco的活性以及Rubisco大亞基和小亞基基因的轉錄水平等進行了測定分析。研究結果發(fā)現(xiàn)，周緣嵌合體TCC(LI-LII-LIII=TCC，LI-莖尖分生組織層最外層；LII-中間層；LIII-最內(nèi)層.T表示榨菜，C表示紫甘藍)的凈光合速率為18.09μmolCO2·m-2·s-1，與親本榨菜相當，但比親本紫甘藍高出24％。而嵌合體的氣孔導度和胞間CO2濃度顯著高于兩個親本。

6、葉綠素熒光參數(shù)中光系統(tǒng)II實際的量子效率(φPSII)和光化學猝滅系數(shù)(qP)在榨菜中最高，而嵌合體和紫甘藍的這兩個參數(shù)基本一致。葉綠素含量測定后發(fā)現(xiàn)，嵌合體的葉綠素a和b的總含量與榨菜的比較接近，比紫甘藍高97％。TCC嵌合體Rubisco酶的初始活性和總活性處于榨菜(最高)和紫甘藍(最低)之間，為1.76和3.75μmolCO2·g-1·min-1。而TCC嵌合體的Rubisco酶大亞基和小亞基基因的相對表達量與榨菜和紫甘藍相比明顯

7、增高。以上結果說明，與TCC嵌合體光合機構的層源親本——紫甘藍相比，其葉綠素含量升高、Rubisco酶的活性以及其大小亞基基因表達的增強導致其凈光合速率的提高?？梢?，TCC嵌合體的異源表皮(來自榨菜)對其內(nèi)部光合組織光合能力的改善有很大的促進作用。 3.對榨菜和紫甘藍種間周緣嵌合體TCC的生殖器官和生殖特性等方面進行了研究。研究結果發(fā)現(xiàn)，TCC嵌合體的有性生長發(fā)育與紫甘藍相近，具有嚴格的綠體春花特性。其抽薹開花習性和花序、花冠形

8、態(tài)也與紫甘藍類似，但在異源表皮——榨菜的影響下發(fā)生了改變，很多形態(tài)指標，如花蕾長、短軸長度，花瓣的長、寬，雄蕊、雌蕊的長度以及花粉粒的大小等都基本介于榨菜和紫甘藍相應指標的中間。此外，對嵌合體進行蕾期自交、雜交后，嵌合體可以產(chǎn)生果實但不能產(chǎn)生種子。從以上的研究可以說明，在TCC嵌合體的有性生殖生長發(fā)育過程中LI(榨菜)與LII和LIII(紫甘藍)之間的相互作用使TCC嵌合體的生殖器官和生殖特性相對于親本發(fā)生了較大變化。從嵌合體花冠的大小

9、和形狀改變以及產(chǎn)生無籽果實的角度來看，嵌合體在花卉和瓜類等作物育種上有很大的應用潛力。 4.以榨菜和紫甘藍種間周緣嵌合體TCC的莖段和葉片為外植體誘導了不定芽的再生。利用形態(tài)標記和分子生物學方法鑒定分析不定芽的起源。經(jīng)統(tǒng)計分析結果顯示，莖段上葉腋處不定芽的誘導頻率隨著MS培養(yǎng)基中BA濃度的增加而升高，而莖段基部不定芽的誘導頻率在含有不同濃度BA的培養(yǎng)基中沒有差異。葉腋處產(chǎn)生的不定芽絕大多數(shù)是榨菜(TTT)，只有4個嵌合體的產(chǎn)生，

10、由此可知：與LⅡ和LⅢ相比，這些不定芽更多的起源于LⅠ層。從莖段基部產(chǎn)生的不定芽全部為紫甘藍(CCC)，說明這些不定芽起源于LⅡ或LⅢ，或者是兩層共同參與的結果。葉片外植體上不定芽的再生頻率在三種不同的NAA和BA組合的培養(yǎng)基之間存在著顯著的差異。葉片切塊邊緣再生的不定芽絕大多數(shù)是紫甘藍(CCC)，70個不定芽中只有2個是嵌合體。從這一結果可以推出：葉片上再生的不定芽絕大多數(shù)是由LⅡ或(和)LⅢ參與形成的，LⅠ參與的幾率較低。另外由試驗

11、發(fā)現(xiàn)，再生的嵌合體類型與其親本TCC的類型相比完全不同。從上述的研究結果可以推出，不定芽的起源會因為外植體從供體植株上的來源不同而發(fā)生改變，而且嵌合體是多細胞甚至是多組織參與起源的。 5.同樣以周緣嵌合體TCC的葉片和莖段為外植體誘導不定根。TCC嵌合體葉片和莖段上的誘導頻率分別為94％和86％，顯著高于它的親本。其中榨菜葉片和莖段不定根的誘導頻率分別為25％和38％，而紫甘藍分別為73％和47％。另外，每株TCC嵌合體不定根的

12、數(shù)目平均是13.11，平均重量為0.274g，這些指標也顯著高于榨菜和紫甘藍。這些結果說明嵌合體異源LⅠ(表皮)與內(nèi)部LⅡ和LⅢ之間可能存在著正向互作從而改善了嵌合體不定根的再生能力。利用PCR技術(聚合酶鏈式反應)和組織解剖學觀察來鑒定不定根的起源部位。鑒定結果顯示，不定根最終起源于LⅢ。 通過本論文的研究，可以發(fā)現(xiàn)種間嵌合體的不同發(fā)育時期和各個器官的特性都受到兩種基因型不同的細胞層相互作用的影響，特別是數(shù)量性狀基本介于兩個親