烏蕨(Stenoloma chusanum)化學(xué)成分研究及其資源利用評價(jià).pdf

1、本文概述了民間藥用植物烏蕨(Stenoloma chusanum(Linn.)Ching)的形態(tài)特征和資源分布情況，綜述了國內(nèi)外對烏蕨的藥理藥效作用、化學(xué)成分的研究進(jìn)展，并對烏蕨所含有的幾種主要化學(xué)成分的生物活性進(jìn)行了總結(jié)。作者提出應(yīng)當(dāng)對烏蕨生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深入研究，還應(yīng)對其引種、繁殖及栽培技術(shù)進(jìn)行研究，為開發(fā)利用這一植物資源建立基礎(chǔ)。作者的主要研究結(jié)果有以下幾個(gè)方面： 1.鳥蕨的化學(xué)成分研究 利用硅膠、聚酰胺、L

2、ichroprep RP-18、Sephadex LH20等層析材料，對烏蕨的乙醇提取物進(jìn)行分離，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)(ESI-MS、HR-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HSQC、HMBC)、標(biāo)準(zhǔn)品對照并參考文獻(xiàn)資料，對分離得到的化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，已分離并鑒定了19個(gè)化合物，它們分別為：烏蕨苷A(stenolomaside A)即[3-(9，3’，5’-三甲氧基-4’-羥基-亞芐基)色滿-4-酮]-5-O-

3、β-D-葡萄糖苷[3-(9，3’，5’-trimethoxy-4’-hydroxy-benzylidene)chroman-4-one]-5-O-β- D-glucoside，該化合物晶體同時(shí)存在反式(1a)和順式(1b)兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)，烏蕨素1(stenolin l)即香草酸-4-O-β-D-(6-O-龍膽?；?-吡喃葡萄糖苷(4-O-β-D-(6-O-gentisoylglucopyranosyl)vanillic acid)(2)，

4、烏蕨素2(stenolin2)即龍膽酸-2-O-β-D-(6-O-龍膽?；?-吡喃葡萄糖苷(2-O-β-D-(6-O-gentisOyl glucopyranosyl)gentisic acid)(3)，葒草苷(Orientin)(4)，葒草苷-2”-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Orientin-2”-O-β-D-glucopyranoside)(5)，牡荊素(Vitexin)(6)，芹菜素(Apigenin)(7)，牡荊素鼠李糖苷(Vi

5、texin thamnoside)(8)，牡荊素吡喃葡萄糖苷(vitexin glucopyranoside)(9)，香草酸(Vanillic acid)(10)，丁香酸(Syringic acid)(11)，龍膽酸(Vanillic acid)(12)，原兒茶醛(protocatechualdehyde)(13)，6，7-二羥基香豆素(6，7-dihydroxycoumarin)(14)，十五烷醇(pentadecanol)(15)，

6、十六烷酸(hexadecanoicacid)(16)，β-谷甾醇(β-sitosterol)(17)，胡蘿卜苷(daucosterol)(18)。其中化合物(1a)、(1b)、(2)和(3)為新化合物，化合物(4)、(5)、(8)、(9)、(10)、(14)、(15)和(16)為首次從該植物中分離得到的化合物。 2.鳥蕨主要成分的定量分析及其資源評價(jià) 作者建立了烏蕨地上部分葒草苷和牡荊素含量的測定方法，檢測不同產(chǎn)地烏蕨中

7、兩種黃酮苷的含量，據(jù)此對烏蕨資源進(jìn)行了評價(jià)，用超聲波提取法提取，RP-HPLC測定，Gemini C18色譜柱，乙腈-1％磷酸溶液(V:V=15:85)為流動相，流速1mL/min，檢測波長340nm。葒草苷在0.025-0.148μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，加樣回收率為100.61％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)2.18％；牡荊素在0.035-0.207μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，加樣回收率為99.77％，RSD2.37％。精密度試驗(yàn)測得葒

8、草苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.10％，牡荊素峰面積的RSD為0.17％.重復(fù)性試驗(yàn)測得葒草苷和牡荊素峰面積的RSD分別為1.10％和0.49％。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明樣品在6h內(nèi)穩(wěn)定。從HPLC圖譜可見，葒草苷和牡荊素為烏蕨中二種主要的黃酮類化合物。在所測定的烏蕨種源中，牡荊素含量均高于葒草苷含量，但兩者的比例不是固定不變的，云南丘北所產(chǎn)烏蕨的葒草苷和牡荊素含量都是最高，分別達(dá)到1.166和1.457mg/g，移栽到南京地區(qū)1年后葒草

9、苷含量下降，牡荊素含量增高。結(jié)果表明，以葒草苷和牡荊素含量為指標(biāo)，云南丘北所產(chǎn)烏蕨是較好的種源。 用超聲提取法提取不同產(chǎn)地烏蕨地上部分的總黃酮，以蘆丁為對照品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH比色法測定總黃酮含量。結(jié)果表明，云南丘北所產(chǎn)烏蕨總酮含量最高，達(dá)127.461mg·g-1，移栽到南京地區(qū)2年后仍保持較高水平；用孢子培育的植株總黃酮含量高達(dá)187.038 mg·g-1；同一產(chǎn)地的烏蕨，葉片總黃酮含量

10、顯著高于葉柄。分析結(jié)果表明，以總黃酮含量為指標(biāo)，云南丘北所產(chǎn)烏蕨是較好的種源，采集烏蕨藥材應(yīng)以葉片為主，通過人工栽培開發(fā)利用烏蕨資源是可行的。 3.鳥蕨中葒草苷爭牡荊素提取純化方法 為了簡便、安全、經(jīng)濟(jì)、有效地從烏蕨中得到單體化合物葒草苷和牡荊素，建立了一種從烏蕨的地上部分提取純化葒草苷和牡荊素的方法，其特征是先從烏蕨地上部分獲得粗黃酮析出物，再將粗黃酮用堿水助溶，稀釋后用酸中和，經(jīng)過反相硅膠柱層析，得到目標(biāo)產(chǎn)物葒草苷和

11、牡荊素，純度達(dá)98％以上。 4.鳥蕨中新化合物的生物活性研究 a.酚性化合物的抗真菌試驗(yàn) 用瓊脂稀釋法(試管法)測定了新化合物烏蕨素1、烏蕨素2及已知化合物香草酸、丁香酸和龍膽酸的抗真菌活性，檢測菌株分別為白念珠菌Candida albicans，新生隱球菌Cryptococcus neoformans，紅色毛癬菌Trichophyton rubrum，須癬毛癬菌Trichophyton mentagrophy

12、tes，犬小孢子菌Microsporum canis，絮狀表皮癬菌Epidermophyton floccosum和黑曲霉Aspergillus niger。烏蕨素1、烏蕨素2、香草酸、丁香酸和龍膽酸對所檢測真菌的最小抑制濃度(MIC)為25-100μgml/L，烏蕨素1和烏蕨素2的抗真菌活性分別低于它們糖苷化前的簡單酚性酸即香草酸和龍膽酸。 b.黃酮類化合物對人腫瘤細(xì)胞的體外生長抑制作用 烏蕨苷A是從烏蕨中分離得到的

13、新化合物，具有高異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)，葒草苷和牡荊素是烏蕨中得量較多的兩種黃酮苷，用MTT法測定了烏蕨苷A、葒草苷和牡荊素在四種濃度(10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L和10-7mol/L)下對5種腫瘤細(xì)胞體外生長的抑制作用。結(jié)果表明，在高濃度(10-4mol/L)時(shí)，3種黃酮類化合物對5種腫瘤細(xì)胞的抑制作用均較小或無效，抑制百分率最大值在20％左右。對于人白血病細(xì)胞HL-60，烏蕨苷A的抑制百分率為18.22％，葒

14、草苷的抑制百分率為13.29％，牡荊素則無效。對于人白血病細(xì)胞K562，葒草苷和牡荊素的抑制百分率分別為19.29％和21.2％，烏蕨苷A的抑制百分率為9.21％。牡荊素對人肺癌細(xì)胞A549的抑制百分率為18.99％，其余樣品均無效.3種黃酮類化合物對人肝癌細(xì)胞HepG2和人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長基本無抑制作用。 5.鳥蕨孢子萌發(fā)、配子體世代形態(tài)變化及孢子繁殖技術(shù)的研究 研究了外界條件對烏蕨孢子萌發(fā)的影響。用隨

15、機(jī)區(qū)組試驗(yàn)和方差分析探討培養(yǎng)溫度、貯藏溫度、GA處理、光照強(qiáng)度對烏蕨孢子萌發(fā)的影響.與室溫(20～25℃)相比，28℃培養(yǎng)的孢子最大萌發(fā)率相近而萌發(fā)速率顯著較高；貯藏溫度(A)極顯著(P<0.01)影響孢子萌發(fā)率，-20℃貯藏降低萌發(fā)率；GA(B)對孢子萌發(fā)率無顯著影響；光照強(qiáng)度(C)極顯著(P<0.01)影響孢子萌發(fā)率，充足光照和弱光照無顯著差異，黑暗處理降低萌發(fā)率；A×B，A×C，B×C及A×B×C交互效應(yīng)不顯著。 采用電鏡

16、、光學(xué)顯微鏡及解剖鏡觀察烏蕨從孢子到孢子葉形成階段的形態(tài)變化，觀察溫度和光強(qiáng)對配子體生長發(fā)育的影響，確定烏蕨孢子繁殖的適宜條件。烏蕨孢子呈腎形，極軸長(48～54)51μm，赤道軸長(31～37)34μm，外壁光滑或具微小疣狀紋飾。播孢后6d孢子開始萌發(fā)，細(xì)胞分裂成為絲狀體，隨后又分裂成心形的原葉體，播孢后45 d原葉體腹面凹口下方產(chǎn)生精子器，播孢后55 d又在腹面凹口生長點(diǎn)下方產(chǎn)生頸卵器。頸卵器形成后繼續(xù)培養(yǎng)12 d可形成幼小的孢子體