基于microRNA表達(dá)譜的變化探討活血消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥療效機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　活血消異方是導(dǎo)師治療氣滯血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥的經(jīng)驗(yàn)方。本研究從文獻(xiàn)梳理、療效觀察、機(jī)理探討3個(gè)方面對活血消異方組方的合理性和科學(xué)性進(jìn)行了探討，期望在現(xiàn)有的西藥及手術(shù)治療方法的基礎(chǔ)上，尋求有效的預(yù)防和治療手段，使更多內(nèi)異癥患者受益。
　　研究目的:
　　圍繞研究目標(biāo)，本項(xiàng)課題從中醫(yī)文獻(xiàn)研究、臨床觀察及microRNA基因表達(dá)，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證三個(gè)部分展開研究。
　　1.文獻(xiàn)研究:本論文結(jié)合古代文獻(xiàn)分

2、析與數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，分析古代婦科文獻(xiàn)中癥瘕病治療方藥的配伍應(yīng)用規(guī)律，為活血消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥治法治則、處方依據(jù)提供理論基礎(chǔ)。
　　2.臨床研究:觀察活血消異方治療卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥的臨床療效，以及治療前后子宮內(nèi)膜異位癥患者血清microRNA基因表達(dá)譜的變化，以臨床療效為出發(fā)點(diǎn)，從基因?qū)用嫣接懟钛惙街委熥訉m內(nèi)膜異位癥可能的生物學(xué)機(jī)制。
　　3.實(shí)驗(yàn)研究:通過建立實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，觀察子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異

3、位病灶體積、組織學(xué)變化，血清和腹腔液相關(guān)炎性因子以及相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的影響，探討活血消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥可能的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.文獻(xiàn)研究:檢索《中華醫(yī)典》收錄的古代婦科醫(yī)著中治療癥瘕的方藥信息，錄入中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)，采用軟件集成的改進(jìn)互信息法、復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類、無監(jiān)督的熵層次聚類等數(shù)據(jù)挖掘方法，分析處方用藥規(guī)律。
　　2.臨床研究:選取醫(yī)院就診的一定時(shí)期內(nèi)，符合納入標(biāo)準(zhǔn)，不符合排除標(biāo)準(zhǔn)的子宮內(nèi)膜異

4、位癥患者作為研究對象，活血消異方加減治療6個(gè)月，觀察治療前后痛經(jīng)、月經(jīng)量改變、慢性盆腔痛等臨床癥狀、體征的改善情況，血清CA125、CA199表達(dá)變化情況以及安全性指標(biāo)變化情況、不良反應(yīng)情況。并于生物樣本庫中隨機(jī)選取5例治療有效的患者，提取治療前、后靜脈血分離的單核淋巴細(xì)胞，提取總RNA，行Real-time qPCR陣列基因芯片做miRNA檢測，對差異表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　3.實(shí)驗(yàn)研究:選用60日齡成熟SD雌性大鼠

5、，采用自體組織移植法造模，造模成功后隨機(jī)分為活血消異方高、中、低劑量組、達(dá)菲林組、模型組、假手術(shù)組、空白對照組，共7組，每組8只，給藥治療3周。觀察異位病灶體積、組織學(xué)變化情況;血清及腹腔液IL-2、IL-6、IL-1β表達(dá)變化情況;NFKB，PIK3R3，RAS基因表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　?。ㄒ唬┪墨I(xiàn)研究:
　　1.本研究共收集治療婦科癥瘕方劑108首，涉及中藥188味，用藥頻次在8次以上的前15位分別是當(dāng)歸、

6、桂心、赤芍、熟地、大黃、莪術(shù)、川芎、三棱、桃仁、炙甘草、干姜、延胡索、牛膝、木香、牡丹皮。其中，以養(yǎng)血、活血、破血、溫陽、理氣、通瘀藥物頻數(shù)較高。
　　2.頻次前10位的藥物組合分別是“當(dāng)歸，桂心”“赤芍，當(dāng)歸”“川芎，當(dāng)歸”“延胡索，當(dāng)歸”“三棱，莪術(shù)”“莪術(shù)，當(dāng)歸”“熟地黃，當(dāng)歸”“川芎，桂心”、“延胡索，桂心”“赤芍，桂心”“牛膝，當(dāng)歸”“桃仁，當(dāng)歸”“莪術(shù)，青皮”，較為常見的組合是以當(dāng)歸為核心:與桂心組合體現(xiàn)了溫通之法，與

7、赤芍、熟地組合體現(xiàn)了養(yǎng)血之法，與三棱、莪術(shù)組合體現(xiàn)了破瘀之法，與青皮、延胡索、川芎組合體現(xiàn)了行氣之法，與桃仁、牛膝組合體現(xiàn)了逐瘀之法。
　　3.網(wǎng)絡(luò)展示圖形式發(fā)現(xiàn)，這些組合的配伍是以活血化瘀法為主，活血、養(yǎng)血、行氣、溫經(jīng)、通瘀是治療癥瘕較為常用的治法。
　?。ǘ┡R床觀察:
　　1.活血消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥患者102例，療程3～6個(gè)月，其臨床總有效率為85.30％。
　　2.不同治療時(shí)間點(diǎn)卵巢囊腫縮減情況差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.055，p＜0.001)，治療3個(gè)月和治療6個(gè)月后卵巢囊腫均較治療前縮小，但前3個(gè)月治療期內(nèi)囊腫消減的趨勢更快。
　　3.隨治療時(shí)間的延長，痛經(jīng)程度明顯緩解，痛經(jīng)持續(xù)時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);治療6個(gè)月期間，患者的中醫(yī)癥狀均有緩解，各個(gè)療程節(jié)點(diǎn)與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.102例患者中月經(jīng)量多患者31例，其月經(jīng)積分在不同時(shí)間點(diǎn)測量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F

9、=19.648，p＜0.01);服藥6個(gè)月經(jīng)周期后較治療前月經(jīng)量明顯減少;服藥4個(gè)月經(jīng)周期后月經(jīng)量多積分不斷減少至正常水平。102例患者中月經(jīng)量少患者11例，服藥6個(gè)月經(jīng)周期后較治療前月經(jīng)量有改善，但不同時(shí)間點(diǎn)測量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.084，p=0.382)。
　　5.治療6個(gè)月后CA125較治療前總體趨勢降低(F=7.101，P=0.024);CA199較治療前總體趨勢降低(F=10.008，P=0.008)，差異有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　6.在數(shù)據(jù)完整的78例患者中，治療前血清TNF-α異常的有2例(2.5％)，治療6個(gè)月后后血清TNF-α異常1例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　7.本研究中納入的患者，在服藥3個(gè)月經(jīng)周期和服藥6個(gè)月經(jīng)周期肝腎功指標(biāo)均未見異常，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，心電圖，血尿常規(guī)均未見明顯異常。
　?。ㄈ﹎icroRNA表達(dá)譜芯片表達(dá):
　　Real-time qPCR陣列

11、基因芯片檢測，共篩選出5個(gè)qRT-PCR驗(yàn)證的有差異表達(dá)的microRNA，其中上調(diào)的基因表達(dá)有miR-202-3p，miR-9-5p，miR-155-5p;下調(diào)的基因表達(dá)有miR-216a-5p，miR-518a-5p。涉及的通路集中在催乳素信號通路，Ras信號通路， Rap1信號通路，Hippo信號通路，雌激素信號通路，神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路，ErbB信號通路，甲狀腺激素信號通路，磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)，MAPK信號通路，TGF-β信號通

12、路，F(xiàn)oxO信號通路，癌癥途徑等信號通路上。這些富集的通路主要與細(xì)胞黏附、遷移以及部分細(xì)胞凋亡功能相關(guān)。
　?。ㄋ模﹦?dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　1.子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在給藥3周后，中藥高劑量、中劑量組和達(dá)菲林組異位病灶體積與給藥前相比明顯變小或者消失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　2.HE染色后，采用半定量組織學(xué)分類方法確定子宮內(nèi)膜異位癥評分發(fā)現(xiàn):達(dá)菲林組和中藥高劑量組的子宮內(nèi)膜異位癥評分明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義(p＜0.05)。中藥低劑量組和中藥中劑量組在降低子宮內(nèi)膜異位癥評分方面優(yōu)勢不明顯(p＞0.05)。
　　3.Real-time PCR對目的基因檢測后發(fā)現(xiàn):正常組與模型組相比，模型組的NFKB，PIK3R3，RAS基因表達(dá)量顯著增高，差異有顯著性（正常組2-△△Ct＞1）;治療后，中藥高劑量組與模型組相比，NFKB，PIK3R3，RAS基因表達(dá)量顯著降調(diào)，差異有顯著性（2-△△Ct＞1）;中藥中劑量組與模型組相比，NFKB，

14、PIK3R3基因表達(dá)量顯著降調(diào)，差異有顯著性(2-△Ct＞1);RAS基因表達(dá)量降調(diào)，但差異無顯著性（2-△△Ct＜1）;治療后，中藥低劑量組與模型組相比，NFKB，PIK3R3，RAS基因表達(dá)量顯著降調(diào)，但差異無顯著性(2-△△Ct＜1)。
　　4.采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測相關(guān)細(xì)胞因子濃度:模型組異位病灶血清和腹腔液IL-2、IL-6、IL-1β的濃度顯著高于正常組、假手術(shù)組和治療組(p＜0.05)。經(jīng)活血消異方高、中

15、劑量組和達(dá)菲林組治療的子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清和腹腔液中IL-2、IL-6、IL-1β的濃度明顯降低(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　活血消異方是基于古代文獻(xiàn)關(guān)于婦科癥瘕類疾病的認(rèn)識(shí)，遵循中醫(yī)立法原則和處方規(guī)律，在繼承和發(fā)展名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上制訂的治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效方劑。臨床觀察表明，活血消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥在消減包塊、緩解痛經(jīng)、改善月經(jīng)、抑制病情方面具有良好的療效，且安全性好，無明顯不良反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表