黑線倉鼠OT-OTR的結(jié)構(gòu)分析與差異表達研究.pdf

1、黑線倉鼠(Cricetulus barabensis)是華北地區(qū)農(nóng)業(yè)害鼠的優(yōu)勢種,其高繁殖力是影響其種群數(shù)量的主要原因之一,因此研究黑線倉鼠的繁殖機制顯得尤為重要。本文從繁殖相關基因入手,從分子水平上揭示害鼠種群數(shù)量波動機制,對鼠害的綜合防控提供新的思路。催產(chǎn)素基因(Oxytocin,OT/Oxt)是與動物繁殖行為密切相關的基因,催產(chǎn)素通過與催產(chǎn)素受體(Oxytocin Recepter,OTR)的結(jié)合,不僅與分娩、射乳有關,還影響著動

2、物的擇偶、攻擊等多種行為。本研究通過分析黑線倉鼠OT及OTR的cDNA序列,預測蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),并分別檢測兩者在不同發(fā)育階段和不同組織器官中的表達情況,預測催產(chǎn)素在黑線倉鼠生長、發(fā)育以及繁殖過程中所起的作用,從而從分子生物學角度尋找控制黑線倉鼠數(shù)量及其危害性的有效方法。
　　本研究以山東省曲阜市吳村鎮(zhèn)和沂南縣蒲汪鎮(zhèn)的農(nóng)田里捕得的黑線倉鼠為研究對象,用RT-PCR方法分別克隆 OT和OTR的部分 cDNA序列。其中,OT cDNA

3、序列314bp, GenBank登錄號:JQ416144;OTR cDNA序列442bp,GenBank登錄號:JN180665。采用分子生物學軟件對兩者的核苷酸序列和氨基酸序列進行分析,并預測其蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明:OT編碼區(qū)的C-Y-I-Q-N-C-P-L-G9個氨基酸殘基構(gòu)成成熟的OT分子,第一位和第六位的兩個Cys之間形成一個二硫鍵,這9個氨基酸殘基之后的部分則形成 OT的運載蛋白,其二級結(jié)構(gòu)中含有較多的β轉(zhuǎn)角,同

4、時應用SWISS-MODEL蛋白質(zhì)同源模建服務器預測得到了OT運載蛋白的部分三級結(jié)構(gòu)。OTR的這部分序列包含完整的OTR的7個跨膜螺旋中的第2、3、4跨膜螺旋和第5跨膜螺旋的一部分,推測第2跨膜螺旋之前的一個胞膜外結(jié)構(gòu)域與 OT羧基端的結(jié)合有關,后一個胞膜外結(jié)構(gòu)域與 OT環(huán)狀結(jié)構(gòu)的識別有關,第3和4跨膜螺旋結(jié)構(gòu)參與 OT分子識別的過程。此外這部分序列中有一個潛在的磷酸化位點和一個潛在的二硫鍵,4個連續(xù)的L結(jié)構(gòu)在穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)過程中起

5、著重要的作用。用SWISS-MODEL蛋白質(zhì)同源模建服務器預測分別得到了其57～87位和1～147位氨基酸的三級結(jié)構(gòu)。使用DNAMAN分別將黑線倉鼠OT和OTR的cDNA序列與大鼠、小鼠、人等幾個物種的相應 cDNA序列進行同源性對比分析,發(fā)現(xiàn)黑線倉鼠與草原田鼠(Microtus ochrogaster)、金倉鼠(Mesocricetus auratus)親緣關系最近,與大鼠、小鼠較近,與偶蹄目和靈長目的幾個物種親緣關系均較遠。

6、　　隨后,本研究還采用實時熒光定量 PCR方法分別比較 OT和OTR在雌雄黑線倉鼠亞成年期、成年發(fā)情期以及老年期三個發(fā)育時期以及腦、心臟以及生殖器官中的相對表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):OT主要在腦中表達,OTR則主要在外周器官表達,因此認為 OT雖然主要在腦中產(chǎn)生,但發(fā)揮生理作用的部位主要在外周器官,這與經(jīng)典的OT神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機制相一致。在發(fā)情期,OT在腦和卵巢中表達均較高,提示了OT對動物發(fā)情行為具有一定影響。在雌性個體的生殖器官中,尤其是子

7、宮中,OT的表達量在成年發(fā)情期和老年期遠遠高于亞成年期,間接說明在亞成年期子宮發(fā)育尚未完全,結(jié)果提示,測定蛋白類激素基因表達量的方法有助于確定雌性黑線倉鼠與發(fā)情、生殖有關的發(fā)育狀態(tài)。另外,發(fā)現(xiàn) OT和OTR在亞成年期個體心臟中均具有較高的表達量,推測 OT對黑線倉鼠心臟發(fā)育及其功能發(fā)揮有重要的調(diào)節(jié)作用,其具體作用機制還需進一步深入的研究。從整體來看,器官差異產(chǎn)生的OTR表達量的差別大于發(fā)育時期不同產(chǎn)生的表達量的差別,但是對于 OT,在特