Tac3-Tacr3在黑線倉鼠繁殖過程中的調(diào)控作用.pdf

1、動(dòng)物的繁殖活動(dòng)是由眾多因子通過錯(cuò)綜復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸活動(dòng)的一個(gè)極其復(fù)雜的過程。動(dòng)物為了獲得最大的繁殖成功率，只在特定的季節(jié)進(jìn)行繁殖活動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為季節(jié)性繁殖。季節(jié)繁殖是影響動(dòng)物種群數(shù)量波動(dòng)的主要原因之一，Tac3/Tacr3在調(diào)節(jié)動(dòng)物季節(jié)性繁殖活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。Tac3編碼神經(jīng)激肽B(NKB），NKB是一種含有特定的十個(gè)氨基酸的多肽；Tacr3編碼NK3R，NK3R是NKB的天然受體，屬于視紫紅質(zhì)七次跨膜

2、G蛋白偶聯(lián)受體家族。黑線倉鼠（Cricetulus barabensis）是典型的季節(jié)性繁殖動(dòng)物，具有春、秋兩個(gè)繁殖高峰期，是研究動(dòng)物季節(jié)性繁殖機(jī)制的理想模型。本研究以黑線倉鼠為材料，采用分子生物學(xué)方法和技術(shù)，檢測(cè)Tac3/Tacr3在黑線倉鼠的不同組織、不同發(fā)育階段及不同季節(jié)的差異表達(dá)，揭示Tac3/Tacr3系統(tǒng)參與動(dòng)物季節(jié)性繁殖活動(dòng)的調(diào)控機(jī)理，旨在從分子水平上探究黑線倉鼠種群數(shù)量的季節(jié)性爆發(fā)機(jī)制。
　　首先，以黑線倉鼠下丘腦

3、為材料，采用普通PCR擴(kuò)增的方法得到黑線倉鼠Tac3 cDNA序列396bp（GenBank登錄號(hào)：KU519331），包括完整的編碼區(qū)序列360bp；獲得Tacr3 cDNA序列1256bp（GenBank登錄號(hào)：KU519332），包括編碼區(qū)序列1244bp。對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，建構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　Tac3編碼119個(gè)氨基酸殘基，前21個(gè)為信號(hào)肽區(qū)域，C末端含有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域，即特征性十肽-Asp-Met-Hi

4、s-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met，是速激肽家族的典型特征。速激肽保守的羧基末端，是速激肽作用于受體的基本結(jié)構(gòu)，這種進(jìn)化過程中的高度保守性說明這一類肽在生命活動(dòng)中有著不可替代的重要作用。Tacr3編碼區(qū)長(zhǎng)1244bp，編碼414個(gè)氨基酸殘基，對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明整體疏水性較強(qiáng)。SMART對(duì)所得氨基酸序列進(jìn)行相關(guān)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該序列存在7個(gè)明顯的高疏水區(qū)域，而這七個(gè)高疏水區(qū)組成七個(gè)完整的α螺旋結(jié)構(gòu)域，屬于典型的G

5、蛋白偶聯(lián)受體家族視紫紅質(zhì)亞家族。使用MEGA5.0軟件對(duì)黑線倉鼠的Tac3/Tacr3核苷酸序列與中國倉鼠、金黃倉鼠、牛、人等多個(gè)物種的相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，所得結(jié)果與傳統(tǒng)物種分類結(jié)果相一致。
　　其次，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Tac3和Tacr3在黑線倉鼠不同組織器官、不同發(fā)育階段、不同季節(jié)中的相對(duì)表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)了不同發(fā)育階段、不同季節(jié)黑線倉鼠血清中NKB/NK3R（Tac3/Tacr3表

6、達(dá)蛋白）的濃度，探究該系統(tǒng)對(duì)繁殖活動(dòng)的調(diào)控模式。
　　通過檢測(cè)Tac3和Tacr3在組織器官間的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tac3和Tacr3在黑線倉鼠下丘腦中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在肝、腎、脾等其他器官組織中的表達(dá)量（P<0.01），而且血清中蛋白含量在不同發(fā)育階段差異并不顯著（P>0.05），表明Tac3/Tacr3系統(tǒng)主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)控作用，下丘腦是Tac3/Tacr3系統(tǒng)作用的關(guān)鍵部位。
　　通過檢測(cè)Tac3和Tacr3在不同

7、發(fā)育階段的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tac3和Tacr3在雌性黑線倉鼠幼體時(shí)期表達(dá)量最高（P<0.05），在雄性黑線倉鼠亞成體時(shí)期表達(dá)量最高（P<0.05），推測(cè)該系統(tǒng)參與調(diào)控黑線倉鼠生殖活動(dòng)的啟動(dòng)，而且時(shí)間上存在著雌雄異型，主要體現(xiàn)在發(fā)育時(shí)期變化上。
　　季節(jié)性差異表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)黑線倉鼠下丘腦中，Tac3在春秋季節(jié)的表達(dá)量顯著高于夏冬季節(jié)（P<0.05），與GnRH的季節(jié)表達(dá)模式相一致，也與黑線倉鼠季節(jié)性繁殖規(guī)律相一致，推測(cè)Tac3

8、的表達(dá)能促進(jìn)GnRH的分泌，對(duì)黑線倉鼠的繁殖調(diào)控起到促進(jìn)作用。雌性黑線倉鼠下丘腦中，受體基因Tacr3在夏秋季的表達(dá)量高于春冬季節(jié)（P<0.05），而雄性個(gè)體在春秋季節(jié)的表達(dá)量高于夏冬季節(jié)（P<0.05），這與GPR54（KiSS1受體)基因的表達(dá)結(jié)果大致相同，推測(cè)黑線倉鼠中Tac3/Tacr3系統(tǒng)與KiSS1/GPR54系統(tǒng)有著密不可分的聯(lián)系。Tacr3在雌性黑線倉鼠的下丘腦中夏季表達(dá)水平最高（P<0.05），推斷此現(xiàn)象可能與光照時(shí)長(zhǎng)