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文檔簡介
1、黑線倉鼠白化突變系(A:CHA)是徐植嵐等人在黑線倉鼠種群內發(fā)現(xiàn)的一種自發(fā)突變的眼皮膚型白化動物。A:CHA品系在體表寄生蟲,皮膚微循環(huán)、輻射防護、以及流行病學等各方面的應用,都表現(xiàn)出了比黑線倉鼠具有更多的優(yōu)越性。A:CHA品系的培育在醫(yī)學研究領域提供了新的動物模型,同時也為我國實驗動物領域增添了一個新型的動物模型品系。
為了進一步分析A:CHA品系白化性狀產生的原因,完善品系的遺傳背景資料,本課題對黑線倉鼠及其A:CHA進行
2、轉錄組測序。首先利用A:CHA品系與黑線倉鼠進行回交后產生F1代小鼠,然后將F1代小鼠進行交配,產生性狀分離的F2代。其中白色的F2代為純合子,而黑色的F2代可能為純合子也可能是雜合子。將黑色的F2代與白色的純合子交配,未產生性狀分離的為純合子。由此產生的黑色和白色純合子,遺傳背景基本一致,在進行RNA-seq分析時,非特異性的差別就會較少。選擇2只黑線倉鼠和白化突變系純合子個體,4只個體分別命名為白1、白2、黑1、黑2,利用TRIZO
3、L法提取2只黑線倉鼠、2只白化突變系純合子個體的皮膚總RNA,經質量檢測合格后,交由華大基因進行RNA-seq測序和分析。
對RNA-seq測序所得基因進行分析,獲得二者差異表達的基因,并利用熒光定量和Western-blot進行驗證,所得結果如下:
1.通過對黑線倉鼠及其白化突變系進行的轉錄組測序,共得到42,665,789條reads,拼接過濾后得到了有注釋的顯著差異基因(FDR≤0.001且log2Ratio≥
4、1)有3675個,其中上調基因有1691個,下調基因有1984個。黑1:白1,黑2:白1,黑1:白2,黑2:白2全部下調大于2倍的基因有92個,全部上調大于2倍的基因69個。黑色素合成通路中酶的變化不明顯,可能細胞內或細胞間的運輸存在障礙,這與前期研究中病理學觀察到的結果相符。按照蛋白質的功能劃分,泛素化蛋白(363個)占總差異蛋白的9.87%,超過了皮膚中總量最多的角質蛋白,推測黑色素的運輸障礙可能與蛋白的泛素化存在一定的關聯(lián)性。
5、r> 2.Gene Ontology功能顯著性富集結果:細胞的組成顯著差異的基因包括中間纖維、中間絲細胞骨架等。分子功能顯著差異蛋白基因包括細胞骨架結合蛋白、受體結合蛋白、酶調節(jié)活性蛋白、結合蛋白以及酰基輔酶A脫氫酶活性蛋白基因等。生物學進程顯著差異的基因包括發(fā)育過程、解剖結構發(fā)育、系統(tǒng)發(fā)育、器官發(fā)育和細胞分化相關基因等。
3.KEGG Pathway顯著性富集結果:黑線倉鼠和A:CHA存在顯著差別的信號通路主要包括PPAR
6、信號通路、脂肪細胞因子信號通路、肥厚性心肌病信號通路、血管平滑肌收縮信號通路、致心律失常性右室心肌病信號通路和甘油酯的代謝信號通路等。
4.應用實時定量PCR方法驗證了高通量測序得到的15個基因,結果表明這15個基因在黑線倉鼠及其白化突變系的表達差異性與測序結果基本一致,從而表明測序數據具有較高的可信度。
5.利用Western-blot對高通量測序的結果中的4種差異蛋白進行了分析,Western-blot結果與高通
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