基于暈動(dòng)癥易感性模型的差異表達(dá)基因篩選與驗(yàn)證.pdf

1、暈動(dòng)癥(motion sickness，MS)是人體暴露于異常加速度環(huán)境，以植物神經(jīng)反應(yīng)為主的多系統(tǒng)反應(yīng)。前期研究表明，性別和年齡在暈動(dòng)癥易感性方面起到了關(guān)鍵作用;暈動(dòng)癥易感性流行病學(xué)調(diào)查顯示，遺傳因素對(duì)于暈動(dòng)癥也具有重要意義;但性別、年齡、遺傳等相關(guān)因素是通過(guò)何種途徑和機(jī)制影響暈動(dòng)癥易感性的，至今沒(méi)有明確的研究報(bào)告。前庭器官受到刺激后，可導(dǎo)致前庭核神經(jīng)元過(guò)度興奮，從而激活前庭-內(nèi)臟反射通路和前庭應(yīng)激通路，使血漿激素水平以及神經(jīng)元活性發(fā)

2、生改變，但前庭核對(duì)暈動(dòng)癥易感性個(gè)體差異的影響機(jī)制尚不明確。本研究在建立動(dòng)物暈動(dòng)癥模型的基礎(chǔ)上觀察旋轉(zhuǎn)后大鼠的胃腸道反應(yīng)（條件性張口和排便反應(yīng)）、自發(fā)活動(dòng)和平衡能力變化、血漿激素水平和腦內(nèi)Fos蛋白表達(dá)水平的改變，初步判斷前庭-內(nèi)臟反射通路在暈動(dòng)癥性別、月齡易感性中的差異;通過(guò)易感性篩選獲得暈動(dòng)癥易感組和不易感組大鼠，進(jìn)一步進(jìn)行前庭核易感性差異表達(dá)基因的篩選;最后檢測(cè)Olr81受體下游信號(hào)通路活性和人同源OR52J3單核苷酸多態(tài)性與暈動(dòng)癥

3、易感性的關(guān)系，并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其基因多態(tài)性與暈動(dòng)癥易感性的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:
　　1、觀察SD大鼠暈動(dòng)癥易感性性別月齡分布及與前庭-內(nèi)臟通路活性的關(guān)系
　　觀察旋轉(zhuǎn)所致的不同性別（雌雄）、月齡（少年:1月齡和2月齡;青年:4月齡和5月齡;中年:13月齡和14月齡）大鼠條件性張口、排便發(fā)應(yīng)、自發(fā)活動(dòng)、平衡能力以及血漿激素水平和腦區(qū)Fos蛋白的改變;
　　2、建立4月齡雄性SD大鼠暈動(dòng)癥易感性模型，篩選并驗(yàn)

4、證前庭核表達(dá)的與暈動(dòng)癥易感性相關(guān)的基因
　　通過(guò)建立暈動(dòng)癥易感性模型，使用基因芯片篩選前庭核內(nèi)差異表達(dá)基因并經(jīng)PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，然后通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)（Elvax前庭核給藥）確定候選基因;
　　3、Olr81下游信號(hào)通路活性及其基因多態(tài)性對(duì)暈動(dòng)癥易感性的影響
　　免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Olr81及其下游特異性G蛋白(Gαolf)在前庭核的分布;不同易感組大鼠旋轉(zhuǎn)后檢測(cè)Olr81下游信號(hào)通路關(guān)鍵酶活性和第二信使表達(dá)水平;以及通過(guò)人群

5、試驗(yàn)，對(duì)Olr81人同源受體OR52J3的基因型和單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè);經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OR52J3單核苷酸多態(tài)性與暈動(dòng)癥易感性的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、與少年和青年組大鼠相比，旋轉(zhuǎn)對(duì)中年大鼠條件性張口以及排便反應(yīng)無(wú)影響，且中年大鼠條件性張口次數(shù)和排便顆粒數(shù)明顯下降;條件性張口未發(fā)現(xiàn)性別差異，但從排便反應(yīng)上看，可發(fā)現(xiàn)1月齡、4月齡和13月齡雌性大鼠比雄性對(duì)暈動(dòng)癥更易感;旋轉(zhuǎn)下，腎上腺素和去甲腎上腺素水平隨著月齡的

6、增長(zhǎng)而升高;旋轉(zhuǎn)可使不同月齡大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、前庭脊束核、孤束核、臂旁核、中央杏仁核區(qū)、內(nèi)側(cè)杏仁核、藍(lán)斑和下丘腦室旁核的Fos蛋白表達(dá)水平顯著增加;4月齡和13月齡大鼠，孤束核和臂旁核的雌性Fos表達(dá)比雄性高;13月齡雌性大鼠藍(lán)斑和下丘腦室旁核Fos蛋白表達(dá)水平比雄性高;
　　2、通過(guò)基因芯片，經(jīng)生物信息學(xué)分析，篩選得到304條前庭核差異表達(dá)基因和10條顯著性代謝通路，確定6個(gè)候選基因:嗅覺(jué)受體(Olr81)、骨架蛋白(Shc1)、

7、膽堿能受體(nAchRα3)、5-羥色胺4受體(5-HT4R)，速激肽1型受體(NK1R)和γ氨基丁酸A型受體(GABAAα6)。并經(jīng)過(guò)PCR對(duì)候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與基因芯片相似;通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制前庭核Olr81表達(dá)后可緩解由旋轉(zhuǎn)所引發(fā)的暈動(dòng)癥癥狀。
　　3、免疫組化結(jié)果可發(fā)現(xiàn)前庭核內(nèi)有Olr81及Gαolf大量表達(dá);暈動(dòng)刺激可使Olr81下游AC/cAMP/PKA通路活性升高而使PLC(PI3K)/PI3通路活性明顯下

8、降;不同基因型人群對(duì)暈動(dòng)癥易感性不同，通過(guò)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人同源OR52J3中rs57026471點(diǎn)突變可能與暈動(dòng)癥易感性有關(guān)，且該突變可顯著提高OR52J3在激動(dòng)劑作用下的細(xì)胞鈣內(nèi)流。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1、在大鼠水平上，暈動(dòng)癥所引起的胃腸道反應(yīng)（條件性張口與排便）和運(yùn)動(dòng)障礙（自主活動(dòng)減少和平衡能力降低）可隨著月齡的增加而所緩解，13月齡和14月齡的大鼠癥狀最輕;還發(fā)現(xiàn)，暈動(dòng)癥與前庭-內(nèi)臟反射通路有關(guān)，且隨著月齡增