成人髓核細(xì)胞特征性表達(dá)基因的篩選與驗(yàn)證.pdf

1、研究背景及目的:
　　腰痛已成為現(xiàn)代社會(huì)中困擾人們生活的主要疾病。據(jù)研究調(diào)查顯示,腰椎間盤退行性病變是引起腰痛的主要原因。目前,研究認(rèn)為腰椎壓應(yīng)力增加,營(yíng)養(yǎng)供給減弱以及遺傳易感性增加是腰椎間盤發(fā)生退行性改變的主要原因。
　　椎間盤由三部分組成。在椎間盤的外周部位為致密的纖維環(huán),其中央部位是膠凍狀的髓核組織,以及緊貼于上下椎體表面的終板軟骨。椎間盤的生理作用主要是通過髓核內(nèi)的蛋白多糖以及Ⅱ型膠原與水分子結(jié)合后產(chǎn)生的靜水壓傳導(dǎo)和

2、抵抗壓力。腰椎間盤可為腰椎提供一定的活動(dòng)度,維持腰椎在各個(gè)方向上的活動(dòng)。而髓核周圍的纖維環(huán)則可限制內(nèi)部髓核組織的移動(dòng)。由于腰椎間盤缺乏血管供應(yīng),其主要營(yíng)養(yǎng)供給主要依靠上下椎體通過軟骨終板的滲透作用。在腰椎退行性改變中,位于腰椎間盤上下面的終板軟骨首先發(fā)生鈣化,引起營(yíng)養(yǎng)滲透作用的減弱,從而導(dǎo)致腰椎間盤內(nèi)的細(xì)胞無法得到充分的營(yíng)養(yǎng)供給而發(fā)生退變。而且,腰椎間盤壓應(yīng)力增加可導(dǎo)致髓核內(nèi)基質(zhì)成分的變化,從而減弱其對(duì)抗重力的作用。
　　目前腰椎

3、間盤退行性疾病的治療手段多種多樣,其中主要包括保守治療和外科手術(shù)治療。保守治療主要針對(duì)疼痛或麻木感不明顯的患者,主要有物理治療,如按摩、牽引和服用塞來昔布等NSAIDS類藥物。但是,如經(jīng)三個(gè)月到半年的正規(guī)保守治療無效,則需要進(jìn)行外科手術(shù)。目前主要的外科手術(shù)方式包括髓核摘除術(shù)和腰椎融合術(shù)等。但是,無論哪種術(shù)式,均是以犧牲患者運(yùn)動(dòng)節(jié)段的方式緩解癥狀,并無法恢復(fù)正常的脊柱運(yùn)動(dòng)功能。所以,目前對(duì)于腰椎退行性疾病的治療手段都存在明顯缺陷。

4、　　近年來,細(xì)胞移植技術(shù)和組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,有望為退變椎間盤疾病提供生物修復(fù)可能。已有動(dòng)物研究證實(shí),首先將髓核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),然后將經(jīng)富集的細(xì)胞移植入受損的椎間盤內(nèi),通過觀察椎間盤高度與其生物力學(xué)特性發(fā)現(xiàn),此方法可以修復(fù)受損的椎間盤。
　　然而,由于髓核組織內(nèi)數(shù)量較少,且來源較少,在一定程度上限制了髓核組織工程的發(fā)展。已有多項(xiàng)研究表明,將BMSC與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后移植入椎間盤內(nèi)后也可達(dá)到治療受損椎間盤的作用。以干細(xì)胞為基

5、礎(chǔ)的髓核組織工程解決了上述問題。
　　但是,由于現(xiàn)在尚缺乏髓核細(xì)胞特征性表達(dá)基因,這限制了干細(xì)胞向髓核細(xì)胞誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的分離和鑒定,進(jìn)而也限制了細(xì)胞治療椎間盤退行性疾病的研究。一直以來,由于其在形態(tài)和功能上與軟骨細(xì)胞相似,髓核細(xì)胞均視為“類軟骨細(xì)胞”,所以一直采用Sox-9和COL2A1等軟骨細(xì)胞標(biāo)志物鑒定髓核細(xì)胞。但是,無論從胚胎發(fā)生、組織分類以及細(xì)胞外基質(zhì)成分上來看,這兩種細(xì)胞都有較大差異。所以,理論上,髓核細(xì)胞應(yīng)有與軟骨細(xì)

6、胞不同的基因表達(dá)譜。
　　迄今為止,僅有少量關(guān)于髓核細(xì)胞特征性表型的研究。Fujita,Sakei,Minogue等人分別在大鼠、犬以及牛的髓核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了其標(biāo)志物。但是由于物種差異,以及脊柱形態(tài)的差異,此研究結(jié)果并不能直接用于人體內(nèi)。Power等通過人體標(biāo)本發(fā)現(xiàn)CAⅫ可用作鑒定人髓核細(xì)胞,但是由于其樣本量少,且樣本為退變的髓核細(xì)胞,所以此結(jié)果也有待進(jìn)一步研究商榷。
　　研究方法與結(jié)果:
　　本實(shí)驗(yàn)首先通過取10對(duì)脊柱

7、骨折內(nèi)固定患者的健康髓核與終板軟骨組織,分別對(duì)髓核細(xì)胞與終板軟骨細(xì)胞進(jìn)行單層培養(yǎng)后,進(jìn)行微陣列基因芯片分別分析其表達(dá)譜,并初步比較兩種細(xì)胞的基因表達(dá)譜的差別。隨后,用同樣的標(biāo)本對(duì)芯片中表達(dá)差異較大的基因進(jìn)行Real-time PCR準(zhǔn)確定量其在mRNA水平的表達(dá)。然后使用Western blot在另外3對(duì)髓核細(xì)胞與終板軟骨細(xì)胞中對(duì)表達(dá)差異較大的基因進(jìn)行蛋白水平定量分析。最后取1對(duì)標(biāo)本分別對(duì)表達(dá)差異最大的蛋白進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析,并采用髓

8、核細(xì)胞和終板軟骨細(xì)胞分別與BMSC共培養(yǎng)后同樣進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證此蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　在微陣列基因芯片中,發(fā)現(xiàn)有15個(gè)基因在髓核細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于軟骨細(xì)胞。然后通過Real-time PCR,我們發(fā)現(xiàn)有三個(gè)基因(POTEB,ROBO4以及EGR4)在髓核細(xì)胞中與軟骨細(xì)胞中的表達(dá)有明顯差異。其中,POTEB的表達(dá)差異倍數(shù)最高。在Western blot中,我們發(fā)現(xiàn)POTEB在兩種細(xì)胞間的表達(dá)存在明顯差