小麥成熟胚脫分化及其植株再生研究.pdf

1、以豫麥18等八種不同基因型小麥成熟胚為外植體，研究了不同處理方式(胚乳支持和胚乳不支持)及不同2，4-D濃度(2mg/L和8mg/L)對(duì)小麥成熟胚愈傷組織脫分化和分化的影響；為了研究小麥成熟胚脫分化和分化的生理特性，我們測(cè)定了與愈傷組織脫分化和分化有關(guān)的(質(zhì)膜H+-ATPase及草酸鹽氧化酶)兩種酶活性，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了分析。為了進(jìn)一步對(duì)小麥成熟胚再生機(jī)理進(jìn)行研究，通過(guò)NorthernBlot對(duì)PMH+-ATPase基因的表達(dá)水平進(jìn)行了

2、研究。為了進(jìn)一步研究PMH+-ATPase的重要作用，我們對(duì)小麥PMH+-ATPase基因進(jìn)行了克隆，并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)PMH+-ATPase的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，包括對(duì)其三維結(jié)果和功能的預(yù)測(cè)。旨在進(jìn)一步研究小麥成熟胚脫分化和分化的效果，為小麥成熟胚高效再生體系機(jī)理的分析提供一定基礎(chǔ)。結(jié)果表明： 1)胚乳不支持條件下，低濃度2，4-D下處理下愈傷組織的誘導(dǎo)率、出苗率分別為82.7％、19.1％;高濃度2，4-D下愈傷組織的誘導(dǎo)率

3、、出苗率分別為82.1％、11.2％；低濃度2，4-D處理有利于小麥成熟胚愈傷組織的脫分化和分化。胚乳支持處理方式的愈傷組織的誘導(dǎo)率較低(52.3％)，但出苗率很高，再生苗率達(dá)65.8％.說(shuō)明胚乳支持的處理方式能高效誘導(dǎo)小麥成熟胚愈傷組織的植株再生。 2)不同處理方式的成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率與綠點(diǎn)率、出苗率間呈一定的負(fù)相關(guān)，有的達(dá)到顯著水平。說(shuō)明出愈率高，但愈傷組織質(zhì)量差，難以分化出再生苗，導(dǎo)致出苗率低。說(shuō)明愈傷組織的質(zhì)量是植株高

4、效再生的關(guān)鍵。 3)胚乳不支持方式下，低濃度2，4-D處理下愈傷組織的草酸鹽氧化酶活性為2.501nmolH2O2/mg.min，高濃度2，4-D處理下愈傷組織的草酸鹽氧化酶活性為2.373nmolH2O2/mg.min，低濃度2，4-D處理有利于小麥成熟胚愈傷組織草酸鹽氧化酶活性的增強(qiáng)；胚乳支持下的愈傷組織酶的活性(2.830nmolH2O2/mg.min)明顯高于胚乳不支持的，達(dá)到顯著水平。因此我們可以認(rèn)為：在小麥愈傷組織分

5、化過(guò)程中，草酸鹽氧化酶有利于胚性愈傷組織形成。 4)在胚乳不支持方式下，低濃度2，4-D處理下愈傷組織H+-ATPase的活性高于高濃度2，4-D的處理；胚乳支持方式下，同濃度2，4-D處理的愈傷組織酶的活性明顯高于胚乳不支持的。且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胚乳支持方式下H+-ATPase活性逐漸升高，72小時(shí)活性最高。結(jié)合胚乳支持下高的出苗率，可以說(shuō)明胚乳支持下生成的胚性愈傷組織比較多，再生能力強(qiáng)。因此我們認(rèn)為：質(zhì)膜H+-ATPas

6、e在小麥成熟胚愈傷組織植株的高效再生中起一定的作用。 5)NorthernBlot研究表明：不同處理方式下小麥成熟胚愈傷組織質(zhì)膜H+-ATPase基因mRNA表達(dá)水平存在差異，胚乳支持的處理方式增強(qiáng)了質(zhì)膜H+-ATPase基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，H+-ATPase基因mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)增加，72小時(shí)表達(dá)量最多，隨后又出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。結(jié)合小麥愈傷組織質(zhì)膜H+-ATPase活性，可以說(shuō)明質(zhì)膜H+-ATPase在

7、小麥成熟胚愈傷組織脫分化和分化過(guò)程中起重要作用。 6)對(duì)克隆的PMH--ATPase基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析表明，基因全長(zhǎng)5770bp，其含有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。對(duì)其推測(cè)的PMH+-ATPas生物信息學(xué)表明，該酶951個(gè)氨基酸組成，分子量為104.6424KD。其一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該酶親水性區(qū)域有10個(gè)明顯的跨膜區(qū)，大部分蛋白質(zhì)伸展到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，且在膜內(nèi)部分有許多β-折疊結(jié)構(gòu)，只有12.7％氨基酸殘基在膜外。存在三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：N

8、-末端5-86區(qū)具有一個(gè)Cation_ATPase結(jié)構(gòu)域，在98-319段是一個(gè)E1-E2-ATPase結(jié)構(gòu)域，在323-609處是一個(gè)hydrolase結(jié)構(gòu)域，屬于P型H+-ATPase。該酶有44個(gè)功能位點(diǎn)，說(shuō)明H+-ATPase活性的調(diào)節(jié)復(fù)雜性。經(jīng)同源性分析：該酶與玉米，番茄，棉花，蠶豆，擬南芥，馬鈴薯，水稻的H+-ATPase相似性分別達(dá)到90.2％，86.8％，84.4％，84.3％，83.1％，81.8％，71.1％，說(shuō)明不