茶樹花粉特異蛋白基因CsPSP1的熒光定量分析及RNAi抑制.pdf

1、熒光定量PCR技術(shù)與RNAi技術(shù)都是上世紀(jì)九十年代分子生物學(xué)領(lǐng)域新興的研究技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)是對生物基因表達(dá)從定性到定量的一個跨越;RNAi技術(shù)是研究基因功能,并能快捷高效抑制基因表達(dá)的方法。它們將會在未來的生物技術(shù)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。
　　茶樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,其主要利用價值都集中在葉片上,從而對品質(zhì)的改良和產(chǎn)量的增加等研究較多,但對于茶花的研究就相對很少,當(dāng)然,在茶花基因水平上抑制茶樹生殖生長來反向提高茶樹

2、經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出的研究就更是微乎其微,本實驗就是研究茶花發(fā)育過程中的相關(guān)基因,為這一較為空白的領(lǐng)域做一些鋪墊性的研究。
　　1、本實驗以黃山早芽、烏牛早、舒茶早、龍井43四個茶樹品種的花蕾為材料,并將每個品種的花蕾按發(fā)育的早、中、晚三個期進(jìn)行分類。以早期花蕾為對照組比較花蕾發(fā)育的各個時期基因表達(dá)量的差異,利用熒光定量PCR的方法確定不同時期花蕾的CsPSP1基因表達(dá)量。實驗結(jié)果表明,黃山早芽、烏牛早、舒茶早、龍井43四個品種的CsPSP1

3、基因表達(dá)量,中期花蕾分別為早期花蕾的1.8、2.7、2.5、6.5倍;晚期花蕾分別為早期花蕾的2.5、3.7、3.1、44.2倍。以上結(jié)果表明在發(fā)育過程中,CsPSP1基因的表達(dá)量.呈上升趨勢,其中龍井43花蕾的早、中、晚三個階段的基因表達(dá)量增加顯著,這可能由品種的差異造成的。通過對實驗數(shù)據(jù)的分析,推斷CsPSP1基因為茶花發(fā)育的晚期基因。
　　2、在熒光定量試驗的基礎(chǔ)上,挑選茶樹龍井43品種的后期花蕾為實驗材料,進(jìn)行普通反轉(zhuǎn)錄得

4、到cDNA第一鏈。同時,根據(jù)GenBank上登錄的茶樹花粉特異蛋白基因CsPSP1(DQ887753)的序列,設(shè)計一對特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增后的基因片段先鏈接到克隆載體pGEM-7zf(+)中,然后再反向插入pBI121表達(dá)載體,并測序。結(jié)果表明,插入pBI121載體的片段長度為318bp,與已知序列進(jìn)行比對后一致性達(dá)到99.02％,說明載體構(gòu)建成功。
　　3、以構(gòu)建好的反義載體pBI121-asCsPSP1為模板,設(shè)計引

5、物,擴(kuò)增出片段asCsPSP1-GUS,其中的GUS只是載體整個GUS基因的一段。之后先插入到重組子pGEM-asCsPSP1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-dsCsPSP1,之后用內(nèi)切酶切下片段dsCsPSP1插入到pBI121中,構(gòu)建雙鏈表達(dá)載體pBI121-dsCsPSP1。由實驗結(jié)果可知插入的雙鏈長度約為1000bp,中間有一段長400bp左右的GUS片段將CsPSP1的正義鏈和反義鏈隔開,重組質(zhì)粒由酶切驗證,表明雙鏈載體構(gòu)建成功。<