應(yīng)用于珙桐基因表達(dá)定量分析的內(nèi)參基因的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、高通量等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析研究中。選擇合適的內(nèi)參基因是運(yùn)用qPCR技術(shù)準(zhǔn)確分析目標(biāo)基因表達(dá)量變化的重要前提。珙桐（Davidia involucrata Baill.）是國家Ⅰ級保護(hù)植物，具有極高的觀賞價(jià)值與科學(xué)研究價(jià)值。目前，對珙桐的基因表達(dá)分析研究日益增多，但有關(guān)內(nèi)參基因的研究尚未見報(bào)道。本研究首次以珙桐作為材料，從珙桐果實(shí)與種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中選取了8個(gè)常

2、用管家基因18SrRNA(18S核糖體RNA)、ACT7（肌動蛋白）、DNAJ（DnaJ蛋白）、EF1a（轉(zhuǎn)錄延伸因子）、eIF（翻譯起始因子）、GA PDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-TUB（β微管蛋白基因）、UBQ（泛素蛋白）與7個(gè)新內(nèi)參基因BADH（甜菜堿醛脫氫酶）、CAC（網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復(fù)合物）、CSD（外被體蛋白δ亞基）、hnRNP（核內(nèi)不均一核糖蛋白）、PP2A（絲氨酸/蘇氨酸磷酸酯酶）、SAND（Sand蛋白）、TI

3、P41（分子量為41 kDa的Tap42互作蛋白）作為候選內(nèi)參基因。運(yùn)用qPCR技術(shù)對15個(gè)候選內(nèi)參基因在珙桐7組不同類型樣本（營養(yǎng)器官、生殖器官、不同顏色葉片、不同發(fā)育階段苞片、不同發(fā)育階段種子、正常種子與敗育種子、所有組織）中的表達(dá)量進(jìn)行測定，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper3種軟件以及幾何平均值法對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，篩選出了適用于不同研究的琪桐內(nèi)參基因。為進(jìn)一步證明篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，在珙

4、桐不同類型樣品中，分別利用目標(biāo)基因DiLTP、DiMYB1、DiLAC對部分內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。最后，對珙桐中表達(dá)穩(wěn)定性好的兩個(gè)新內(nèi)參基因BADH、CAC進(jìn)行了克隆。通過以上研究，本文主要得到以下結(jié)論:
　　1.不同珙桐組織樣品中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性不同，而各自不同組織樣品中又有特定的表達(dá)相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。營養(yǎng)器官樣品中，BADH、EF1α、hnRNP是表達(dá)穩(wěn)定性排名前三的基因，適合作為內(nèi)參基因;生殖器官樣品中，BA

5、DH、eIF、CAC是表達(dá)穩(wěn)定性排名前三的基因，適合作為內(nèi)參基因;不同顏色葉片樣品中，SAND、18S rRNA、eIF是表達(dá)穩(wěn)定性排名前三的基因，適合作為內(nèi)參基因;不同發(fā)育階段苞片樣品中，TIP41、CAC、CSD是表達(dá)穩(wěn)定性排名前三的基因，適合作為內(nèi)參基因;不同發(fā)育階段種子樣品中，CAC、CSD、BADH是表達(dá)穩(wěn)定性排名前三的基因，適合作為內(nèi)參基因;正常種子與敗育種子樣品中，SAND、CAC、eIF是表達(dá)穩(wěn)定性排名前三的基因，適合作

6、為內(nèi)參基因;所有組織樣品中，BADH、CAC、DNAJ是表達(dá)穩(wěn)定性排名前三的基因，適合作為內(nèi)參基因?？傊?，所有候選內(nèi)參基因中，新內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性普遍優(yōu)于常用管家基因，其中新內(nèi)參基因BADH與CAC較管家基因表現(xiàn)更優(yōu)。
　　2.基因表達(dá)分析中，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性、表達(dá)量與選用數(shù)目都會對定量結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。在珙桐基因表達(dá)研究中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)具體的樣品類型和目標(biāo)基因，選擇在該試驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定且表達(dá)量與目標(biāo)基因接近的內(nèi)參基因或內(nèi)

7、參基因組合進(jìn)行校準(zhǔn)，以提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　3.珙桐新內(nèi)參基因BADH命名為DiBADH，登錄號KX655718，基因序列長度966bp，編碼322個(gè)氨基酸，氨基酸序列與茶樹BADH氨基酸序列的相似度最高;珙桐新內(nèi)參基因CAC命名為DiCAC，登錄號KX268525，基因序列長度1317bp，編碼438個(gè)氨基酸，氨基酸序列與葡萄、可可等植物的CAC氨基酸序列相似度最高。
　　該研究為在珙桐中合理選用內(nèi)參基因以及準(zhǔn)確進(jìn)行