四環(huán)素類污染物毒性的微觀機制研究.pdf

1、蛋白質是生命的物質基礎，它與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起，機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。細胞是生物有機體進行新陳代謝活動的基本單位，外環(huán)境中的有害因子，如物理性因子（電離輻射、噪聲、紫外線等）、化學性因子和生物性因子（細菌、病毒等）等，通過不同途徑（如呼吸道、消化道、皮膚及傷口等）作用于機體，能誘發(fā)機體結構與功能發(fā)生改變，而這些改變無不反映細胞結構與功能的變化。細胞結構與功能的改變是機體受到外源性有害物質作用所

2、致?lián)p傷的基礎。
　　 四環(huán)素類藥物在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中有廣泛應用。由于生物利用率較低，50-80％的四環(huán)素類藥物未經(jīng)代謝而進入環(huán)境成為污染物。殘留在土壤、地表水、地下水、甚至飲用水等環(huán)境以及動物源食品（如蛋、奶、肉等）中的四環(huán)素類污染物能經(jīng)由食物鏈或以飲食方式進入人體，對人類健康形成威脅。四環(huán)素類藥物殘留的污染問題及其毒性已引起了世界范圍內(nèi)的關注，并已有大量相關報道，但國內(nèi)外已有的研究成果還不能徹底闡釋環(huán)境中藥物殘留對生態(tài)及人

3、類健康的內(nèi)在作用機制。本論文在已報道的相關研究成果的基礎上，以四環(huán)素類污染物致機體毒性的作用靶點功能蛋白質和細胞為對象，研究了常見四環(huán)素類污染物（土霉素OTC、四環(huán)素TC和金霉素CTC，TCs）毒性的微觀機制，得到以下研究結果:
　　 1、OTC和TC與血清白蛋白相互作用的機理研究
　　 血清白蛋白是各種內(nèi)源性和外源性化合物在血液中運輸?shù)妮d體。本文在利用公式校正熒光內(nèi)濾效應的基礎上研究了OTC和TC與血清白蛋白（BSA和

4、HSA）的相互作用。分子探針的研究結果表明，OTC和TC與位于血清白蛋白子域ⅢA的位點Ⅱ結合。計算得到的△(H)和△(S)分別為負值和正值，說明OTC和TC與血清白蛋白非共價結合的主要作用力為靜電作用力。利用分子模擬方法進一步確定OTC和TC的結合位置為位于位點Ⅱ的正電荷氨基酸殘基（對于BSA為ARG433或ARG436，對于HSA為ARG410或LYS414）。紫外可見吸收光譜、同步熒光光譜和圓二色譜的實驗結果表明，結合的OTC和TC

5、導致血清白蛋白的二級結構和色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變。相關研究結果已分別發(fā)表在Biomacromolecules和JournalofAgriculturalandFoodChemistry上。
　　 2、TCs與其毒性相關的功能蛋白酶的作用機理研究
　　 已有研究結果表明，TCs能使過氧化氫酶、溶菌酶和胰蛋白酶等功能蛋白酶的活性下降。本文利用光譜學技術結合分子對接研究了TCs毒性的微觀機制。實驗結果表明:(1)OTC以一個

6、結合位點通過范德華力和氫鍵作用力與過氧化氫酶作用形成復合物。結合的OTC使過氧化氫酶的二級結構和色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變，使過氧化氫酶活性受到抑制;(2)OTC、TC和CTC以一個結合位點與位于溶菌酶表面裂縫的活性中心中的兩個關鍵氨基酸殘基(Glu35或Asp52)作用，競爭性抑制溶菌酶活性，結合強度的順序為:CTC＞TC＞OTC。分子對接和熱力學分析的結果均表明，靜電作用力在TCs與溶菌酶的作用過程中占主導地位。結合的TCs使溶菌酶的

7、二級結構和色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變。(3)OTC、TC和CTC均能以一個結合位點與胰蛋白酶通過范德華力和氫鍵作用力作用形成復合物，結合強度的順序為:TC＞OTC＞CTC。結合的TCs能抑制胰蛋白酶活性，抑制程度大小順序為:CTC＞OTC＞TC。分子對接和胰蛋白酶活性實驗的結果均表明OTC和TC與胰蛋白酶的S1結合口袋結合，競爭性抑制酶活性;由于在CTC苯環(huán)上的氯原子阻礙苯環(huán)進入S1結合口袋，CTC與胰蛋白酶的非酶活性中心位點結合，非競

8、爭性抑制胰蛋白酶活性。結合的TCs使胰蛋白酶的二級結構和色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，但不同的結合位置使CTC對胰蛋白酶二級結構的影響與OTC和TC相反。相關工作已分別發(fā)表在ScienceofTheTotalEnvironment,Chemosphere和PLoSONE上。
　　 3、TCs對人血紅細胞毒性的作用機理研究
　　 常見的TCs（OTC和TC）均能進入紅細胞，本文考察了其對紅細胞毒性的微觀作用機理。研究結果表明

9、:(1)OTC能引起紅細胞抗氧化防御體系功能下降，導致紅細胞氧化應激，導致以下毒性效應:使紅細胞的形態(tài)發(fā)生變化，并進一步導致紅細胞溶血（OTC濃度大于8×10-5molL-1）。在低濃度下(≤4×10-5molL-1)，OTC能使紅細胞ATP酶活性增強;隨濃度進一步增大，OTC能抑制ATP酶活性，影響細胞功能;(2)利用流式細胞術探索性建立反映紅細胞抗氧化性的指標（谷胱甘肽和活性氧）的檢測方法，并考察了TC對其含量的影響。結果表明，TC

10、能導致紅細胞谷胱甘肽含量減少，從而使細胞抗氧化防御體系功能降低，導致細胞氧化/抗氧化平衡穩(wěn)態(tài)被破壞，進而使ROS濃度升高，造成氧化應激，能引起細胞結構和功能的損傷;(3)OTC和TC均以一個作用位點與血紅蛋白通過范德華力和氫鍵作用力結合形成復合物。同步熒光實驗和分子對接均表明，OTC和TC在血紅蛋白上的結合位置為四個亞基之間的中央空穴。結合的OTC和TC能改變血紅蛋白的結構和酪氨酸殘基的微環(huán)境。部分研究結果已經(jīng)在JournalofHaz