生物自顯影法篩選白蘞酯提物抗菌活性[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　生物自顯影法篩選白蘞酯提物抗菌活性</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物工程 &l

2、t;/p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要: 本實(shí)驗(yàn)研究了白蘞酯提物中是否有物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)起

3、抑制作用，采用的方法是生物自顯影法，該法具有高效，快速的特點(diǎn)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入經(jīng)稀釋的菌液，將其涂布在酯提物層析板上，層析板上的抗菌物質(zhì)經(jīng)展開(kāi)后與其他物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)培養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)無(wú)菌區(qū)域，層析板經(jīng)噻唑藍(lán)顯色后成淺藍(lán)色，而無(wú)菌區(qū)域則成無(wú)色，無(wú)色區(qū)域出現(xiàn)的地方即白蘞抗菌物質(zhì)所在。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在薄層板的中上端部分出現(xiàn)白色無(wú)菌斑點(diǎn)，性狀橢圓，規(guī)則一致，與顯色區(qū)域界線清晰，證實(shí)在該區(qū)域含抗菌

4、物質(zhì)。通過(guò)兩種菌的結(jié)果顯示，白蘞酯提物對(duì)以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陰性菌抑制作用較為明顯。</p><p>　　關(guān)鍵詞:酯提物 生物自顯影 薄層層析</p><p>　　Bioautography Screening Ampelopsis antibacterial activity of Ethylacetate extract</p><p>　　Abstr

5、act: In this study, Ampelopsis ester extractings was adopted to study whether there are substances inhibiting the growth of e. coli or staphylococcus aureus . Bioautography which is efficient, quick characteristic employ

6、ed to plan experiments, adding in beef anointed specially designed by dilute bacterium fluid，Will its coating in ester extractings from chromatography board, the launch of the antibacterial substance esters extractings f

7、rom with other not-as-bad, via coating after incubation</p><p>　　Experimental results showed that there could be sterile white spots in the upper portion of the thin layer plate ,which were oval characters,

8、rules consistent with the clear color boundaries, confirmed in the region containing antibacterial substances. By the results of the two bacteria, Ampelopsis ester extractings were the more obvious inhibition of Staphyl

9、ococcus aureus as the representative of Gram-negative bacteria.</p><p>　　Keywords: Ester extracting thin layer plate Bioautography</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要 …

10、……………………………………………………………………………………… （Ⅰ）</p><p>　　Abstract ………………………………………………………………………………………（Ⅱ）</p><p>　　1 緒論 …………………………………………………………………………………………（1）</p><p>　　1.1選題的背景、意義………………………………………

11、……………………………（1）</p><p>　　1.2生物自顯影法簡(jiǎn)介……………………………………………………（1）</p><p>　　1.3生物自顯影法分類…………………………………………………………（2）</p><p>　　1.4新型高效生物自顯影技術(shù)…………………………………………………………（3）</p><p>　　1.5白蘞

12、化學(xué)成分…………………………………………………………（3）</p><p>　　1.6展望…………………………………………………………………（4）</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容……………………………………………………………………………（5）</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)流程………………………………………………………………………………（5）</p>

13、;<p>　　2.2 分析方法………………………………………………………………………………（6）</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容………………………………………………………………………………（8）</p><p>　　3 結(jié)果與分析…………………………………………………………………………………（10）</p><p>　　4 結(jié)論…………………

14、………………………………………………………………………（12）</p><p>　　5 致謝…………………………………………………………………………………………（13）</p><p>　　參考文獻(xiàn)………………………………………………………………………………………（14）</p><p><b>　　1 緒論</b></p>

15、<p>　　1.1 選題的背景、意義</p><p>　　從天然產(chǎn)物中篩選、分離和提取天然抗菌成分已成為天然防腐劑和新藥研發(fā)等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，篩選得到的產(chǎn)物往往需要進(jìn)行生物活性鑒定，傳統(tǒng)的鑒定方法需要在整個(gè)動(dòng)物或者是器官上進(jìn)行，這樣不僅需要大量的活體實(shí)驗(yàn)體，還需要大量的目標(biāo)提取物，實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，操作要求高，無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)要求，這樣就使得我們?nèi)ふ也⒔㈧`敏、方便、快捷且經(jīng)濟(jì)的活性檢測(cè)方法，目前都采用微量

16、生物活性物質(zhì)的鑒定方法，如酶法[1]，微生物抑菌法，免疫原法，生物自顯影法等，其中生物自顯影法又以其快速，方便等特點(diǎn)成為生物活性物質(zhì)檢測(cè)與定性的首要選擇。</p><p>　　1.2 生物自顯影法簡(jiǎn)介[2] </p><p>　　普通生物自顯影技術(shù)是一種利用薄層色譜來(lái)對(duì)生物活性進(jìn)行測(cè)定的方法，薄層色譜是一種分離色譜，他能將天然產(chǎn)物初提物中的活性成分和非活性成分在薄層板上很好的分離并展開(kāi)，

17、再通過(guò)與混合了微生物（各種真菌，致病菌，病原微生物）的培養(yǎng)基相接觸，通過(guò)一定的手段培養(yǎng)，培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)不同的區(qū)域，一個(gè)是被微生物覆蓋的區(qū)域，即非活性區(qū)域，另一個(gè)出現(xiàn)抑菌圈的地方則是活性區(qū)域，相對(duì)薄層板上的展開(kāi)位置就是生物活性物質(zhì)的所在，通過(guò)洗脫劑可將其收集。再參考該物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)展開(kāi)樣板，則可得知該物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分子式等信息。 </p><p>　　1.3、TLC生物自顯影技術(shù)的分類[3]</p>

18、<p>　　1.3.1 瓊脂擴(kuò)散法</p><p>　　瓊脂擴(kuò)散法是較早的一種生物自顯影法，其操作步驟就是最原始的步驟，所需要注意的是，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可在培養(yǎng)基中加入一定量的四挫鹽（如MTT，INT等），四挫鹽本身顏色較淺，但是它在接觸了微生物的代謝產(chǎn)物之后會(huì)變成深色，有助于我們的判斷，還有一點(diǎn)就是如果薄層板采用的是硅膠吸附劑，那么可以在硅膠和培養(yǎng)基之間放置一張濕潤(rùn)的濾紙，因?yàn)榄傊姓承裕?它與硅膠層

19、接觸后會(huì)產(chǎn)生黏著，會(huì)破壞抑菌圈的觀察。</p><p>　　1.3.2 直接TLC生物自顯影法</p><p>　　該法與上述方法的區(qū)別是它的載體由培養(yǎng)基變成了薄層板，用特制培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)菌制成菌懸液，然后將菌懸液噴灑在展開(kāi)完成的薄層板上，一定潮濕避光的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，同樣加入一定量的四挫鹽，但是該方法只適用于那些能在薄層板上很好生長(zhǎng)的真菌類微生物。</p><p&g

20、t;　　1.3.3 瓊脂覆蓋法</p><p>　　瓊脂覆蓋法是上訴兩種方法的綜合，它是以薄層板為載體，但不是采用噴灑式，而是將融有菌的瓊脂熔融液均勻覆蓋到薄層板上，等到瓊脂凝固后再在一定的條件下培養(yǎng)，用四挫鹽染色后，就可以觀察到結(jié)果，該方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)結(jié)果的影響較小，可以放心大膽的實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　1.4、新型高效生物自顯影技術(shù)</p><p>　

21、　1.4.1 HPTLC生物自顯影技術(shù)</p><p>　　高效薄層色譜（HPTLC）生物自顯影技術(shù)[4]，他在薄層板的制作上加以改進(jìn)，它采用粒度分布很窄的微粒硅劑（5-10um）制備高效薄層板，用程序多級(jí)展開(kāi)或圓形展開(kāi)技術(shù)使薄層色譜的靈敏度和分辨率大大提高。相對(duì)于TLC色譜，他有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）分辨率提高，分辨率與吸附微粒的半徑的平方成反比。（2）分析時(shí)間變短，展開(kāi)速度與吸附劑顆粒半徑成正比，故顆粒越小，展開(kāi)速

22、度越慢，但是由于分離效率大大提高，所以分析時(shí)間還是變短。（3）檢出靈敏度增加。</p><p>　　1.4.2 二維生物自顯影技術(shù)</p><p>　　所謂二維生物自顯影技術(shù)就是一個(gè)薄層，兩次展開(kāi)[5]的意思。先用極性展開(kāi)劑將薄層板展開(kāi), 調(diào)轉(zhuǎn)90°后再用非極性展開(kāi)劑第2次展開(kāi), 這樣在一塊薄層板上就同時(shí)展開(kāi)了極性和非極性成分。相對(duì)于二維薄層色譜，TLC法有以下不足：一維薄層色譜

23、不易將成分復(fù)雜的樣品完全分離，致使抑菌斑點(diǎn)的歸屬不清；不能將活性成分完全從薄層板中轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，尤其會(huì)影響含量較少和不易擴(kuò)散活性成分的表達(dá)；活性成分?jǐn)U散到培養(yǎng)基后，由于平板培養(yǎng)基較厚，活性成分可擴(kuò)散的空間較大，不易形成位置準(zhǔn)確、輪廓清晰的抑菌斑點(diǎn)。</p><p>　　1.5、白蘞簡(jiǎn)介與化學(xué)成分</p><p>　　1.5.1 白蘞簡(jiǎn)介</p><p>　　白蘞[

24、6]又名白根、貓兒卵, 具有清熱散結(jié)、生肌止痛功效, 白蘞為葡萄科蛇葡萄屬植物白蘞( A m pelopsis japonica(Thunb.) Makino) 的塊根。白蘞入藥歷史已久,早在《名醫(yī)別錄》中已有記載，是歷代醫(yī)家治療疔癰的重要植物。近代臨床報(bào)道其多用于治療外科炎癥,扭挫傷。</p><p>　　1.5.1 白蘞主要化學(xué)成分</p><p><b>　?。?）多酚類&

25、lt;/b></p><p>　　多酚類是白蘞的主要化學(xué)成分，也是其主要活性物質(zhì)。包括沒(méi)食子酸，1,2,6-三氧-沒(méi)食子?；?β-D-吡喃葡萄糖，1,2,3,6-四氧-沒(méi)食子?；?β-D-吡喃葡萄糖，1,2,4,6- 四氧- 沒(méi)食子?；?β-D- 吡喃葡萄糖，1,2,3,4,6-五氧-沒(méi)食子?；?β-D-吡喃葡萄糖，二聚沒(méi)食子酸，1,4,6-三氧-沒(méi)食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖，2,4,6- 三氧- 沒(méi)食子

26、?；?D- 吡喃葡萄糖，2,3,4,6- 四氧- 沒(méi)食子?；?D- 吡喃葡萄糖，6- 氧- 二聚沒(méi)食子?；?1,2,3-三氧-沒(méi)食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖，槲皮素-3-氧-α-L-吡喃鼠李糖，槲皮素-3-氧-(2- 氧-沒(méi)食子?；?-α-L- 吡喃鼠李糖。這些多酚類物質(zhì)有的具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性，有的具有很強(qiáng)的抗毒肝素活性[7]。</p><p><b>　?。?） 有機(jī)酸類</b>&

27、lt;/p><p>　　用硅膠柱層析從白蘞的乙醇提取物中分離得到脂肪酸三十烷酸和二十八烷酸。</p><p>　　（3） 三萜、甾醇及其苷類</p><p>　　用硅膠柱層析從白蘞乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物中分離得到β-谷甾醇、豆甾醇和豆甾醇-β-D- 葡萄糖苷。</p><p><b>　?。?）其他</b></p&g

28、t;<p>　　白蘞中的蒽醌類主要有大黃素甲醚、大黃酚和大黃素等。從白蘞的甲醇提取物中分離得到具有抗腫瘤活性的momordins，包括momordin I，Id 和 Ie。白蘞中還含有衛(wèi)茅醇、淀粉和黏液質(zhì)[8]等</p><p>　　1.5.3白蘞乙酸乙酯提取物</p><p>　　俱赫軍[9]等人從白蘞的乙酸乙酯提取物中萃取分離到了8種物質(zhì)，分別鑒定為沒(méi)食子酸(1) 、原兒

29、茶酸(2) 、龍膽酸(3) 、白藜蘆醇(4) 、大黃素(5) 、羽扇豆醇(6) 、β- 谷甾醇(7) 、胡蘿卜苷(8) 。</p><p><b>　　1.6、發(fā)展前景</b></p><p>　　隨著人類對(duì)化學(xué)藥品危害的認(rèn)識(shí)，天然生物藥物已經(jīng)逐漸嶄露出蓬勃的趨勢(shì)，所以，快速，簡(jiǎn)便，有效的分離方法也將在未來(lái)分離技術(shù)中占據(jù)著重要的位置，生物自顯影技術(shù)雖然才發(fā)展了幾十年，

30、但由于其優(yōu)越的性能與特點(diǎn)，已經(jīng)成為了生物分離技術(shù)的主攻點(diǎn)。掌握好生物自顯影技術(shù)，并加以改善和精進(jìn)，對(duì)人類健康，壽命，對(duì)社會(huì)穩(wěn)定發(fā)展等都有其非凡的意義。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)流程 </p><p>　　本課題采用的是直接TLC生物自顯影法，以完成展開(kāi)的薄層板為載體，將含菌液的培

31、養(yǎng)基涂布至上面。實(shí)驗(yàn)流程如下：</p><p><b>　　菌種</b></p><p><b>　　菌種活化</b></p><p><b>　　試劑與儀器滅菌</b></p><p><b>　　制備菌懸液濃度梯度</b></p><

32、;p><b>　　確定最佳菌懸液濃度</b></p><p><b>　　白蘞酯提物的提取</b></p><p>　　酯提物層析，分離抗菌物質(zhì)</p><p><b>　　薄層板培養(yǎng)</b></p><p><b>　　噻唑藍(lán)溶液的配置</b>&l

33、t;/p><p><b>　　顯色劑顯色</b></p><p>　　抑菌圈大小與Rf值的測(cè)定</p><p>　　圖2-1實(shí)驗(yàn)流程示意圖</p><p><b>　　2.2 分析方法</b></p><p>　　白蘞酯提物經(jīng)展開(kāi)劑展開(kāi)后在薄層板上形成展開(kāi)條帶，將酯提物中的抗菌

34、物質(zhì)與其他物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，涂布上還有菌液的培養(yǎng)基之后，抗菌物質(zhì)與培養(yǎng)基中的菌液會(huì)互相滲透，菌種就會(huì)在薄層板上生長(zhǎng)，菌種的代謝產(chǎn)物也會(huì)留在薄層板上，而含有抗菌物質(zhì)的區(qū)帶就會(huì)因無(wú)法生長(zhǎng)菌種，而不含菌代謝產(chǎn)物，從而無(wú)法與顯色劑呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，會(huì)在薄層板上出現(xiàn)斑點(diǎn)。</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容</b></p><p><b>　?。?）菌種的選擇&l

35、t;/b></p><p>　　大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，菌種選取試驗(yàn)室儲(chǔ)藏的群種，活性中等。</p><p><b>　?。?）儀器的準(zhǔn)備</b></p><p>　　試驗(yàn)過(guò)程需要的試劑與儀器</p><p>　　試劑：牛肉膏，蛋白胨，nacl，鹽酸，硅膠，瓊脂，甲醇，氯仿，石油醚，丙酮，95%乙醇，噻唑藍(lán)。&l

36、t;/p><p>　　儀器：錐形瓶250ml 6個(gè)，小試管10個(gè)，試管2個(gè)，培養(yǎng)皿4個(gè)，移液管10ml，2支</p><p>　　托盤天平，燒杯若干，接種針，酒精燈，打火機(jī)，移液槍，棉花，玻璃棒，玻璃板，涂布棒。</p><p>　　表2-1 實(shí)驗(yàn)涉及主要儀器</p><p><b>　　（3）培養(yǎng)基的制備</b></

37、p><p>　　由于試驗(yàn)選擇的方式是TLC直接生物自顯影法，所以制備的培養(yǎng)基要求瓊脂含量較低，根據(jù)瓊脂含量的不同制備兩種培養(yǎng)基，</p><p>　　牛肉膏，蛋白胨，nacl，瓊脂都選自實(shí)驗(yàn)室，</p><p>　　用電子天平稱取牛肉膏1.5g，蛋白胨5.0g。nacl 2.5g，水500ml，每樣各兩份，放于鍋中煮，稱取瓊脂4.0g與8.0g兩份，剪碎，放置與鍋中煮，

38、變煮變攪拌，加水至體積為500毫升左右，保證瓊脂完全溶解，調(diào)ph7.4~7.6，將起裝至錐型瓶中，保證每瓶中培養(yǎng)基含量為150ml以下，扎口備用。編號(hào)1.2.3與A.B.C，其中數(shù)字類為瓊脂含量低的培養(yǎng)基，用于以薄層板為載體的培養(yǎng)基涂布使用，字母類的為瓊脂含量高的培養(yǎng)基，用于做試管斜面，與以培養(yǎng)皿為載體的培養(yǎng)基的制備。</p><p><b>　　（4）儀器的滅菌</b></p>

39、<p>　　收取10支小試管，洗凈，晾干，用移液槍在每只試管里裝4.5ml的水。并編號(hào)1到10，</p><p>　　需要滅菌的儀器與試劑有，已分裝培養(yǎng)基的錐形瓶，已裝水的小試管，用報(bào)紙包好的培養(yǎng)皿4個(gè)，試管2支，一盒移液槍的槍頭。</p><p>　　將上述所有物品放入高壓蒸氣滅菌鍋，進(jìn)行高壓滅菌，121℃，保持30分鐘，待壓力磅指針回復(fù)到零位時(shí)，打開(kāi)高壓鍋蓋，待鍋內(nèi)溫度下

40、降到60～70C。取出，放置與超凈臺(tái)，備用。</p><p><b>　?。?）菌種活化</b></p><p>　　取字母類培養(yǎng)基，微波爐中火加熱2分鐘，置于超凈臺(tái)中，取已滅菌的試管兩只，酒精棉擦拭手面，在每支試管中倒入約五分之一的培養(yǎng)基，架空頭部使其形成菌種斜面，靜止冷卻使其凝固。</p><p>　　用接種針挑取稍微原菌樣，在培養(yǎng)基斜面中

41、劃線，制成菌種斜面，編號(hào)大腸與金葡，放入培養(yǎng)箱中，38℃倒置培養(yǎng)8小時(shí)。</p><p><b>　　（6）菌懸液的制備</b></p><p>　　取已滅菌的小試管與槍頭于超凈臺(tái)中備用，取出以活化的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌，用接種針在大腸菌落上挑取少許，在1號(hào)試管內(nèi)搖勻，搖勻后用500微升移液槍移取0.5ml的菌液至2號(hào)試管，換槍頭后移取0.5ml的群液至3號(hào)試管，

42、同樣的操作到5號(hào)試管為止，換菌樣，挑去菌液到6號(hào)試管，同樣操作到10號(hào)試管，這樣就制備了菌液濃度為10-5的菌樣，置于超凈臺(tái)中備用。</p><p>　　（7）白蘞酯提物溶液的制備的制備</p><p>　　選用實(shí)驗(yàn)室已提取的白蘞酯提物，</p><p><b>　?。?）薄層板的制備</b></p><p>　　選取質(zhì)

43、量較好，表面平整的玻璃片→30% 的鹽酸浸泡玻璃板10min →自來(lái)水沖洗→洗</p><p>　　衣粉水浸泡10min →自來(lái)水沖洗→豎著放置烘干→稱取一定量的薄層層析硅膠→加少量水(2-2.5倍)研磨均勻→涂板→平放，室溫下自然干燥→100度除水活化1小時(shí)→用紙包好→放入干燥器備用。</p><p><b>　?。?）展開(kāi)劑的選擇</b></p>&

44、lt;p>　　展開(kāi)劑的選擇是該試驗(yàn)的重難點(diǎn)所在，取少量白蘞酯提物用甲醇溶解備用。</p><p>　　石油醚與丙酮配比1:1，點(diǎn)樣點(diǎn)3，層析結(jié)束后發(fā)現(xiàn)除了起點(diǎn)與終點(diǎn)之外，在薄層板上未出現(xiàn)展開(kāi)點(diǎn)。</p><p>　　石油醚與丙酮配比2:1，點(diǎn)樣點(diǎn)3，層析結(jié)束后發(fā)現(xiàn)除了起點(diǎn)與終點(diǎn)之外，在薄層板上未出現(xiàn)展開(kāi)點(diǎn)。</p><p>　　石油醚與丙酮配比5:1，點(diǎn)樣點(diǎn)3

45、，層析結(jié)束后發(fā)現(xiàn)在薄層板上中上層出現(xiàn)一個(gè)展開(kāi)點(diǎn)。</p><p>　　石油醚與丙酮配比9:1，點(diǎn)樣點(diǎn)3，層析結(jié)束后發(fā)現(xiàn)在薄層板中部出現(xiàn)展開(kāi)點(diǎn)。</p><p>　　氯仿與甲醇配比8:1，點(diǎn)樣點(diǎn)3，層析結(jié)束后發(fā)現(xiàn)在薄層板近頂端出現(xiàn)展開(kāi)點(diǎn)。</p><p>　　氯仿與甲醇配比10:1，點(diǎn)樣點(diǎn)3，層析結(jié)束后發(fā)現(xiàn)在薄層板近頂端出現(xiàn)展開(kāi)點(diǎn)。</p><p&

46、gt;　　最終經(jīng)培養(yǎng)效果來(lái)看，氯仿與甲醇的配比效果比較明顯，配比比例選10:1.</p><p>　　（10）硅膠板層析；</p><p>　　取少量已提取的酯提物于干凈燒杯中，加入些許甲醇使其能夠溶解，搖勻備用。</p><p>　　用鉛筆在已活化的硅膠板下端處劃一平行于底邊的細(xì)線并等距離標(biāo)志點(diǎn)樣點(diǎn)。用毛細(xì)管沾在酯提物溶解液中些許時(shí)間，在以標(biāo)記的點(diǎn)上點(diǎn)樣，反復(fù)點(diǎn)三

47、次。</p><p>　　在層析缸中加入10ml氯仿與1ml甲醇，注意這些物質(zhì)都是揮發(fā)性物質(zhì)，操作要快，蓋上蓋子使其飽和五分鐘，然后迅速放入以點(diǎn)好樣的硅膠板，蓋上蓋子，等待其層析結(jié)束。</p><p>　　層析結(jié)束后用吹風(fēng)機(jī)輕輕吹去展開(kāi)劑，放置于紫外燈下觀察，可以看見(jiàn)各個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)有一展開(kāi)條帶，并在條帶中上部有一范圍稍大，顏色稍深的點(diǎn)。放置陰暗干燥處備用。</p><p&g

48、t;<b>　?。?1）涂布</b></p><p>　　取數(shù)字類培養(yǎng)基與微波爐中中火加熱2分鐘，取出置于超凈臺(tái)備用，取已制備好梯度的菌懸液備用，取已層析完成的硅膠板備用，講培養(yǎng)基倒取一定量于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用移液槍移取1ml菌液于培養(yǎng)皿中，用涂布棒攪勻，在其凝固之前將其均勻涂布到硅膠板上，靜置5min，編號(hào)大腸與金葡，涂布完成后先將其放于兵箱中4時(shí)，過(guò)后將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。&l

49、t;/p><p>　?。?2）噻唑藍(lán)溶液的配置</p><p>　　在陰暗的條件下稱取噻唑藍(lán)固體0.5g，量取100毫升的磷酸緩沖溶液，無(wú)菌條件下將噻唑藍(lán)固體溶解于磷酸緩沖溶液中，配置成5mg/ml的噻唑藍(lán)指示劑溶液，用錫紙包住后保存于黑暗處，備用。</p><p><b>　　（13）染色</b></p><p>　　取出

50、培養(yǎng)完成的薄層板，置于陰暗環(huán)境下，噴灑噻唑藍(lán)指示劑，靜置5min由于噻唑藍(lán)指示劑是3級(jí)毒性物質(zhì)，且極易揮發(fā)，所以操作過(guò)程要帶手套，靜置時(shí)要保證環(huán)境的陰暗。</p><p>　?。?4）結(jié)果測(cè)定與數(shù)據(jù)記錄</p><p>　　層析板經(jīng)噻唑藍(lán)噴灑之后會(huì)呈現(xiàn)淺藍(lán)色，而含有抑菌物質(zhì)的區(qū)域則會(huì)出現(xiàn)白色斑點(diǎn)，迅速用相機(jī)拍攝下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用尺子量取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括：白色斑點(diǎn)的直徑大小，層析點(diǎn)到抑菌斑點(diǎn)的距離

51、，層析點(diǎn)到溶劑前沿的距離。</p><p><b>　　結(jié)果與分析</b></p><p>　　最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示，白色斑點(diǎn)即為含抗菌物質(zhì)的區(qū)域背景為藍(lán)色</p><p>　　圖3-1最終顯色結(jié)果顯示 左為金黃色葡萄球菌，右為大腸桿菌 </p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如上圖所示，每個(gè)板的近頂端的位置都出現(xiàn)了所謂的不顯色

52、區(qū)域，該區(qū)域成橫向橢圓狀，色淺，與周圍區(qū)別明顯，說(shuō)明該區(qū)域內(nèi)確實(shí)是含有抑菌物質(zhì)，從而使該區(qū)域無(wú)法出現(xiàn)顯色反應(yīng)，在陰暗的條件下噴灑噻唑藍(lán)（MTT）顯示劑，（噻唑藍(lán)的顯色原理活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。）擱置5分鐘左右，需要存放在絕對(duì)陰暗的地方，過(guò)后可以發(fā)現(xiàn)硅膠板上大背景的顏色是呈現(xiàn)淺藍(lán)色，但是在硅膠板的最上端出現(xiàn)了幾個(gè)空白點(diǎn)，空白點(diǎn)與周圍的區(qū)分較為清晰可見(jiàn)，且

53、與各自的點(diǎn)都一一對(duì)應(yīng)，證明該些點(diǎn)為白蘞酯提物抗菌物質(zhì)純?cè)诘膮^(qū)域。</p><p>　　表3-1 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌斑大?。īL）</p><p>　　由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，白蘞乙酸乙酯提取物對(duì)以金黃色葡萄球菌代表的革蘭氏陽(yáng)性菌具有稍強(qiáng)的抑菌效果，原因可能為細(xì)菌細(xì)胞壁極性差距的原因。</p><p>　　表3-2 抗菌活性成分的Rf</p><

54、p>　　根據(jù)菌的Rf值可以初步判定白蘞乙酸乙酯提取物中的抗菌物質(zhì)是何物質(zhì)。</p><p>　　該實(shí)驗(yàn)采用的是直接TLC生物自顯影法，該方法的特點(diǎn)是以薄層板為載體，這樣就具有了比較好的靈活性，之前實(shí)驗(yàn)嘗試過(guò)用瓊脂擴(kuò)散法，即以裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿為載體，該方法有點(diǎn)是我們比較難以克服的，就是將薄層板置于培養(yǎng)基上進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)交換的時(shí)候，不知道是時(shí)間控制的不當(dāng)還是操作上的失誤，經(jīng)培養(yǎng)后的結(jié)果是凡是硅膠板蓋過(guò)的地方都未

55、曾長(zhǎng)菌，而且瓊脂擴(kuò)散法經(jīng)噻唑藍(lán)顯色后效果比較難以 分辨，所以最終選擇了直接TCL生物自顯影法，該種方法的優(yōu)點(diǎn)是效果顯而易見(jiàn)，只要存在抑菌物質(zhì)，就可以很容易的得到無(wú)菌區(qū)域。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)所選取的菌液濃度為10-5，這是根據(jù)純培養(yǎng)的效果來(lái)選定的，先將實(shí)驗(yàn)室的菌樣活化備用，在無(wú)菌條件下制成菌液濃度為10-4到10-7三個(gè)濃度梯度，涂布培養(yǎng)到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)10-5培養(yǎng)出來(lái)的菌落稀疏度比較適合

56、做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，由于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)是10-7所以究其原因可能是原菌樣的活性不夠?qū)е屡囵B(yǎng)濃度的降低。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)選取的展開(kāi)劑是氯仿配比甲醇10:1的比例，就現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件而言，該比例并不是固定的，很多氯仿與甲醇的配比出來(lái)的結(jié)果基本是一致的，石油醚與丙酮出來(lái)的效果也很相近，受實(shí)驗(yàn)條件的限制，又由于該實(shí)驗(yàn)室定性實(shí)驗(yàn)，所以就未在展開(kāi)劑上做大量的實(shí)驗(yàn)，選取了實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)較好的氯仿配比甲醇10:1的比例。</p&

57、gt;<p>　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要用到兩種不同瓊脂含量的培養(yǎng)基，這是根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的得失的出來(lái)的經(jīng)驗(yàn)，原先是只配了字母類培養(yǎng)基，在前期菌種活化等都未出現(xiàn)問(wèn)題，到最后進(jìn)行硅膠板涂布的時(shí)候，由于瓊脂含量較高，所以在溫度還不算低的時(shí)候就已經(jīng)出現(xiàn)了凝固的趨勢(shì)，稍微克服一下還是將其與菌液混合，這時(shí)就已經(jīng)有凝固態(tài)培養(yǎng)基的出現(xiàn)了，這樣就導(dǎo)致培養(yǎng)基與菌液無(wú)法充分混合，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)最好要求是菌液與培養(yǎng)基的配比比例為1:100，將其涂布到硅膠板上

58、后做培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)并未出現(xiàn)任何結(jié)果，可能是由于瓊脂含量過(guò)高，硅膠板上的化學(xué)物質(zhì)與培養(yǎng)基之間進(jìn)行交換出現(xiàn)了較大阻礙，所以實(shí)驗(yàn)最終選擇了兩種培養(yǎng)基濃度</p><p>　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在硅膠板涂布結(jié)束后要先擱置于4℃冰箱中4小時(shí)，原理是在菌的活性被抑制的時(shí)候，使得硅膠板上的抑菌物質(zhì)很好的滲透到培養(yǎng)基中，然后再將其放置與培養(yǎng)箱中38℃培養(yǎng)12小時(shí)，這樣的出來(lái)的效果是最好的。</p><p><

59、b>　　4 結(jié)論與討論</b></p><p>　　4.1 酯提物薄層層析情況</p><p>　　生物活性物質(zhì)的層析是一項(xiàng)很繁瑣的工作，由于其中物質(zhì)的極性差距比較大，所以在現(xiàn)有的條件下要將其中的所有物質(zhì)完全分離開(kāi)來(lái)是不可能的，層析過(guò)程遇到的阻礙也比較多，剛開(kāi)始的時(shí)候酯提物溶液配的過(guò)于稀薄，展開(kāi)之后根本無(wú)法在板上觀察到展開(kāi)條帶，后來(lái)放棄了配酯提物溶液的想法，直接挑取少量

60、酯提物與燒杯中，后倒入少量甲醇溶解，混勻后作為備用溶液，在這樣的條件下可以明顯的在硅膠板上看到展開(kāi)條帶，</p><p>　　選取不同展開(kāi)劑的配比的區(qū)別其實(shí)就是抗菌物質(zhì)出現(xiàn)在硅膠板的哪個(gè)位置的區(qū)別，各種配比下氯仿與甲醇的效果稍微好點(diǎn)，但是可能由于板長(zhǎng)的問(wèn)題抑或是實(shí)驗(yàn)操作問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)最后的結(jié)果并不如第一次選擇展開(kāi)劑時(shí)的結(jié)果好，抑菌斑點(diǎn)出現(xiàn)在展開(kāi)劑的頂端部位，雖然未能將其完全展開(kāi)，但已經(jīng)可以說(shuō)明白蘞酯提物中含有抗菌物質(zhì)

61、。</p><p>　　4.2 最終結(jié)果討論</p><p>　　從最終的結(jié)果來(lái)看，白蘞酯提物中確實(shí)存在著生物活性物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）與革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）存在抑制作用，由于該實(shí)驗(yàn)室定性實(shí)驗(yàn)，所以無(wú)法得出到底是一種物質(zhì)對(duì)菌類有抑制作用還是多種物質(zhì)對(duì)菌類有抑制作用，從實(shí)驗(yàn)效果來(lái)看，這種抑制是比較明顯的。后續(xù)試驗(yàn)可以用洗脫劑對(duì)層析板進(jìn)行洗脫，洗脫出來(lái)的物質(zhì)會(huì)按層析板上的順

62、序流出，從而可以快速的得到抑菌物質(zhì)，該方法的優(yōu)點(diǎn)就是速度與簡(jiǎn)潔，缺點(diǎn)也比較明顯，就是得到的物質(zhì)無(wú)法確定是其化學(xué)組成，得做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)才可得知是何物質(zhì)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 曲建博.TLC生物自顯影技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用[J].中草藥, 2005,36(1):132-137 </p><p>

63、　　[2] 何佳.利用二維生物自顯影技術(shù)快速檢測(cè)追蹤金錢松內(nèi)真菌抗細(xì)菌活性成分[J].食品科學(xué), 2008,29(2):252-256</p><p>　　[3] 劉欣.荸薺英抑菌成分活性跟蹤方法的研究[J].食品科學(xué)，2005,26(7):78-81 </p><p>　　[4] 孔陽(yáng).蝙蝠葛莖葉石油醚提取物抗菌及食物防腐作用的研究[J].食品科技,2010,35(3):246-249&

64、lt;/p><p>　　[5] 將紅梅.石香薷提取物抑制黃曲霉機(jī)制的初步研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2007,7(4):47-50 </p><p>　　[6] 赫　軍.白蘞的化學(xué)成分[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25(8):636-638 </p><p>　　[7] 俞琦.白蘞醇提物免疫活性的初步研究[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)報(bào)學(xué)院,2005,27(2):20-21 &

65、lt;/p><p>　　[8] 李紅娟.白蘞的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].食品與藥品,2007,9(10):60-62</p><p>　　[9] 郝淑賢.生物自顯影技術(shù)在荸薺英抑菌成分分離中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004:88-91 </p><p>　　[10] 谷利華.應(yīng)用薄層色譜一生物自顯影技術(shù)評(píng)價(jià)烏藥等三種中藥的抗氧化活性[J].醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2006,41

66、(10):956-962 </p><p>　　[11] 程瑛琨.雞骨草醇提物抗菌活性研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2006,20 (2):39-41 </p><p>　　[12] Wedge D E, Nagle D G. A new 2D-TL C bioautography method f or the discovery of novel anti fun gal agen

67、t s t o control plant pathogens [ J] . J N at Prod , 2000, 63( 8):1050-1054</p><p>　　[13] M.B.Muller.A New Bioautographic Screening Method for the Detection of Estrogenic Compounds[J]. Chromatographia.2004:2