黃芪注射液對(duì)慢性腎炎氣虛血瘀證大鼠模型的藥效學(xué)研究

1、<p>　　黃芪注射液對(duì)慢性腎炎氣虛血瘀證大鼠模型的藥效學(xué)研究</p><p>　　作者：楊倩春，楊霓芝，陳伯鈞，雷娓娓，王樺，馬紅巖 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 黃芪 </p><p>　　摘要：【目的】觀察黃芪注射液對(duì)大鼠慢性腎炎氣虛血瘀證模型的治療作用?！痉椒ā縎D大鼠48只，除12只作空白對(duì)照組外，其他大鼠均在慢性腎炎模型的基礎(chǔ)上加造

2、氣虛血瘀證模型后，隨機(jī)分為模型組、黃芪高劑量組(8g/kg)和黃芪低劑量組(4g/kg)，每組12只；給藥4周后，檢測(cè)模型大鼠的一般狀態(tài)、腎功能、細(xì)胞免疫功能及腎組織病理學(xué)改變，進(jìn)行組間療效比較?！窘Y(jié)果】黃芪高、低劑量組對(duì)模型大鼠的一般狀態(tài)、生化指標(biāo)及腎組織的病理?yè)p害均有改善作用，并呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系?！窘Y(jié)論】黃芪注射液能提高慢性腎炎氣虛血瘀證大鼠的細(xì)胞免疫功能，改善血凝狀態(tài)，減輕腎組織病理?yè)p害，有防治慢性腎炎的作用。 </p&g

3、t;<p>　　關(guān)鍵詞：黃芪注射液/藥理學(xué)；腎小球腎炎/中藥療法；腎小球腎炎/免疫學(xué)；腎小球腎炎/病理學(xué)；氣虛血瘀；疾病模型，動(dòng)物；大鼠 </p><p>　　應(yīng)用具有益氣作用的黃芪注射液治療慢性腎小球腎炎病人，臨床已取得一定的療效。在此基礎(chǔ)上，我們觀察了黃芪注射液對(duì)慢性腎炎氣虛血瘀證模型的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </

4、b></p><p>　　11 動(dòng)物 </p><p>　　健康低齡(3周)雄性SD大鼠(體質(zhì)量約100g)4只，雄性新西蘭兔8只，雄性SD大鼠48只(200～250g)，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠合格證號(hào)：2002A004；新西蘭兔合格證號(hào)：2001A067。 </p><p>　　12 試劑與儀器

5、 </p><p>　　兔抗鼠Thy1抗血清(AST)自備；完全弗氏佐劑由Sigma公司提供；抗兔IgG熒光抗體，由天象人公司提供；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗大鼠IgG由Sigma公司提供；億鳴-200病理圖像分析儀，由廣州億鳴科技有限公司提供。 </p><p>　　13 藥物 </p><p>　　黃芪注射液每10mL含原生藥

6、20g，由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：0305061。 </p><p>　　14 分組 </p><p>　　雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為4組，每組12只：模型組(A組)、黃芪高劑量組(B組)、黃芪低劑量組(C組)、空白對(duì)照組(D組)。 </p><p>　　15 大鼠慢性腎炎模型的制備 </p>

7、<p>　　抗Thy1系膜增殖性腎炎模型的建立參照文獻(xiàn)［１］，步驟如下： </p><p>　　151 免疫New Zealand(NZ)白兔 </p><p>　　低齡SD雄性大鼠4只，麻醉后取胸腺，剪碎并擠出胸腺細(xì)胞，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾除去混雜的組織，濾液為淋巴細(xì)胞懸液，以等體積生理鹽水和完全弗氏佐劑稀釋至1×１０１０／Ｌ，注射至兔背部皮

8、下，每只３×１０７個(gè)胸腺細(xì)胞；第2、4周時(shí)分別靜脈注射３×１０７個(gè)胸腺細(xì)胞，強(qiáng)化免疫。 </p><p>　　152 測(cè)定抗血清效價(jià) </p><p>　　第2次靜脈注射胸腺細(xì)胞后第3天，從兔耳緣靜脈取血2mL，測(cè)定血清抗胸腺細(xì)胞抗體的效價(jià)。方法如下：分離大鼠胸腺細(xì)胞，用生理鹽水稀釋至１×１０１１／Ｌ，取1滴細(xì)胞懸液滴于干凈玻片，吹干，

9、用體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精固定5min，吹干；將正常NZ白兔血清、抗血清原液及其1∶10、1∶20、1∶40、1∶80及1∶160的稀釋液各80μL滴加在胸腺細(xì)胞涂片上，均勻散開(kāi)；37℃孵育40min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)(001mol/L,pH74)沖洗；加抗兔熒光抗體(效價(jià)1∶10)，37℃孵育40min，PBS沖洗；當(dāng)效價(jià)大于1∶80(即1∶80的稀釋液仍有較強(qiáng)的染色)時(shí)將兔放血，離心后，將血清保存于-40℃。 </p&g

10、t;<p>　　153提純血清 </p><p>　　兔抗血清用飽和硫酸銨法提純，抗血清(體積設(shè)為mL)中加入等體積的PBS(001mol/L,pH 74)及2倍體積的飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，在4℃旋轉(zhuǎn)30min后，以6000～9000r/min離心15min，去上清(為白蛋白部分)，沉淀溶于PBS中，再加入2mL飽和硫酸銨溶液，4℃旋轉(zhuǎn)30min，6000～9000r/mi

11、n離心15min，沉淀繼續(xù)溶于PBS中，如上重復(fù)3次。最后將沉淀溶于少量PBS中，在4℃透析24h，用鈉氏試劑檢測(cè)無(wú)銨離子時(shí)即得粗制的抗體IgG，經(jīng)測(cè)定蛋白濃度后，于-20℃保存。 </p><p>　　154 大鼠抗Thy1抗體腎炎模型的制作 </p><p>　　空白對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水20mL/kg；其余各組均于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日腹腔麻醉后由尾靜脈注射AST 10m

12、L/kg和正常兔血清10mL/kg。 </p><p>　　16 大鼠氣虛血瘀模型的建立 </p><p>　　參考文獻(xiàn)［２］方法，在實(shí)驗(yàn)第2周時(shí)，對(duì)各組大鼠行游泳疲勞試驗(yàn)，連續(xù)2周。 </p><p>　　17 給藥劑量及途徑 </p><p>　　給藥劑量參考文獻(xiàn)［２］。在首次注射AST后

13、的第2天開(kāi)始，模型組予以生理鹽水10mL&#12539;kg－１&#12539;d－１，高劑量組予以黃芪注射液8g&#12539;kg－１&#12539;d－１，低劑量組予以黃芪注射液4g&#12539;kg－１&#12539;d－１，均尾靜脈注射；空白對(duì)照組不施加任何處理因素，自由飲食。全部大鼠于造模后第2周末及第4周末用代謝籠收集24h尿液，并于第4周末行眼球摘除采血后，處死取腎組織。

14、 </p><p><b>　　18 觀察指標(biāo) </b></p><p>　　181 一般狀況 </p><p>　　觀察造模后各組大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、體毛、飼料量、大小便及活動(dòng)情況等。 </p><p>　　182 24h尿蛋白定量 </p><p

15、>　　分別在第2周末及第4周末用代謝籠分批收集各組大鼠的24h尿液，用磺基水楊酸比濁法進(jìn)行測(cè)定。 </p><p>　　183 尿纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)測(cè)定 </p><p>　　用乳膠定性法進(jìn)行測(cè)定。 </p><p>　　184 血清尿素氮、肌酐測(cè)定 </p><p><b&

16、gt;　　采用電極法。 </b></p><p>　　185 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定 </p><p>　　采用T淋巴細(xì)胞AMAE復(fù)合物染色對(duì)比法［３］，計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞。 </p><p>　　186腎組織學(xué)檢查 </p><p>　　括免疫熒光檢查、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察。 &

17、lt;/p><p>　　1861 免疫熒光學(xué)檢查 </p><p>　　取小塊腎皮質(zhì)組織作冰凍切片，用FITC標(biāo)記的兔抗大鼠IgG(效價(jià)1∶64)作直接熒光染色，AO onetwenty熒光顯微鏡觀察。熒光強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［４］：“-”：未見(jiàn)熒光；“±”：低倍鏡下不顯現(xiàn)，高倍鏡下似乎可見(jiàn)；“+”：低倍鏡下似乎可見(jiàn)，高倍鏡下可見(jiàn)；“++”：低倍鏡下可見(jiàn)，高倍

18、鏡下清晰可見(jiàn)；“+++”：低倍鏡下清晰可見(jiàn)，高倍鏡下耀眼；“++++”：低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼。 </p><p>　　1862光學(xué)顯微鏡觀察 </p><p>　　取部分腎組織用體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛固定，階梯乙醚脫水，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅染色(HE)和過(guò)碘酸雪夫氏反應(yīng)染色(PAS)，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照；每例標(biāo)本任選10個(gè)腎小球，采用病理圖像

19、分析儀計(jì)算每個(gè)腎小球內(nèi)的系膜細(xì)胞數(shù)，測(cè)量每個(gè)腎小球的直徑，并作統(tǒng)計(jì)分析。 </p><p>　　1863 電子顯微鏡觀察 </p><p>　　每組3只大鼠分別選取1mm２大小腎組織3塊作電鏡觀察，常規(guī)用20g/L戊二醛前固定，10g/L鋨酸后固定，階梯乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂EPN 812包埋，超薄切片，并行鈾和鉛雙重染色后，置JEM-1200 EX電子顯微鏡下觀察超微

20、結(jié)構(gòu)。 </p><p>　　19 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 </p><p>　　計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；分類資料采用χ２檢驗(yàn)。 </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　21 一般情況 </p><p>　　在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組有1例大鼠

21、死亡。造模之后各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的精神不振、攝食減少、生長(zhǎng)遲緩、身體消瘦、蜷縮、體毛無(wú)光澤、大便稀爛等現(xiàn)象，尤以模型組最為顯著。 </p><p>　　22 24h尿蛋白定量測(cè)定 </p><p>　　結(jié)果見(jiàn)表1。表1 黃芪注射液對(duì)24h尿蛋白定量的影響（略） </p><p>　　23 血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)測(cè)定

22、 </p><p>　　結(jié)果見(jiàn)表2。表2 黃芪注射液對(duì)血清BUN、SCr含量的影響（略） </p><p>　　24 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定 </p><p>　　結(jié)果見(jiàn)表3。表3 黃芪注射液對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響（略） </p><p>　　25 尿FDP定性測(cè)定 </p>

23、;<p>　　模型組大鼠尿FDP檢測(cè)全部陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%；黃芪高劑量組4例陽(yáng)性，陽(yáng)性率333%；黃芪低劑量組5例陽(yáng)性，陽(yáng)性率417%；高、低劑量組與模型組比較均有顯著性差異(Ｐ＜005)。 </p><p>　　26 腎組織學(xué)檢查 </p><p>　　261 免疫熒光檢查 </p><p>　　結(jié)果見(jiàn)表4。表4 黃芪注

24、射液對(duì)大鼠腎皮質(zhì)免疫熒光強(qiáng)度的影響（略） </p><p>　　262 光鏡檢查 </p><p>　　空白對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)正常(圖1a)；模型組腎小球增大，腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)增多，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管管腔受壓，腎小球囊腔狹窄，近曲小管上皮細(xì)胞呈輕度或中度水腫(圖1b)；黃芪高、低劑量組與模型組比較，系膜細(xì)胞增多現(xiàn)象均有減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)消失，近曲小管上皮

25、細(xì)胞內(nèi)水腫明顯好轉(zhuǎn)(圖1c、d)。對(duì)每例標(biāo)本任選10個(gè)腎小球，采用病理圖像分析儀計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球內(nèi)的系膜細(xì)胞數(shù)，測(cè)量每個(gè)腎小球的直徑，以及從腎小球極到血管極的長(zhǎng)度，結(jié)果見(jiàn)表5。表5 黃芪注射液對(duì)腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)、腎小球大小的影響（略） </p><p>　　263 電鏡檢查 </p><p>　　空白對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖2a，圖3a)；模型組系膜細(xì)胞增多，系膜區(qū)基質(zhì)增

26、生，系膜區(qū)增寬，有云霧狀致密物在系膜區(qū)沉積，基底膜稍增厚，毛細(xì)血管管腔輕、中度變窄，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度或中度腫脹(圖2b，圖3b)；黃芪高劑量組與模型組比較，系膜細(xì)胞增生情況減輕，基底膜恢復(fù)正常，系膜區(qū)增寬情況減輕，足細(xì)胞的足突未融合，毛細(xì)血管管腔病變情況消除，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)腫脹(圖2c，圖3c)；黃芪低劑量組與模型組比較，病理改變均輕于模型組，但重于黃芪高劑量組(圖2d，圖3d)。 </p><p>&l

27、t;b>　　3 討論 </b></p><p>　　31 模型的選擇、制備及評(píng)價(jià) </p><p>　　根據(jù)國(guó)內(nèi)1 397例慢性腎衰的資料分析，在引起終末期腎衰的各種病因中，慢性腎炎占首位，達(dá)6419%［５］。而系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)是我國(guó)原發(fā)性腎小球疾病中最常見(jiàn)的病理類型，據(jù)統(tǒng)計(jì)約占我國(guó)腎穿刺病人的50%左右［６］。1997年世界衛(wèi)生

28、組織(WHO)腎病委員會(huì)正式把MsPGN作為腎小球腎炎中一個(gè)獨(dú)立類型，以持續(xù)性蛋白尿和血尿?yàn)樘卣?，它的主要病理變化是腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞基質(zhì)增多，可導(dǎo)致腎小球纖維化和腎小球硬化［７］。 </p><p>　　慢性腎炎屬于中醫(yī)學(xué)的“水腫”、“腰痛”等范疇，后期可屬“虛勞”范疇，其發(fā)病多為本虛標(biāo)實(shí)。慢性腎炎病程長(zhǎng)，久病不愈，導(dǎo)致正氣虛弱，其中以肺、脾、腎三臟虧虛為主。肺主一身正氣；脾為后天之本、氣血生化之源，主運(yùn)

29、化；腎為先天之本，主水液。肺虛不能通調(diào)水道，水液內(nèi)停；脾虛則運(yùn)化失司，濕濁內(nèi)生；腎虛則氣化功能失常，內(nèi)生水濕，均導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，血行遲滯而成瘀；氣為血帥，氣行則血行，氣虛無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，阻滯而成瘀。有研究認(rèn)為氣虛血行不暢導(dǎo)致瘀血，虛與瘀均貫穿疾病的始終［８］，慢性腎炎的發(fā)病過(guò)程中氣虛血瘀型所占比例約563%［９］。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選擇陳氏Thy1大鼠腎炎模型，其特點(diǎn)是：①該模型接近人體慢性腎炎病

30、變；②采用抗胸腺細(xì)胞血清法誘發(fā)大鼠系膜增殖性腎炎，方法簡(jiǎn)單，模型成功率高，可達(dá)100%［７］。該模型病變明顯，且能較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在，首次注射Thy1抗血清后，每周1次，連續(xù)4次［１０］，模型在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)更加穩(wěn)定。我們?cè)诖笫竽I炎造模過(guò)程中，進(jìn)行了大鼠游泳疲勞試驗(yàn)，復(fù)制出慢性腎炎氣虛血瘀證模型，因此本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型既具有中醫(yī)腎“病”的特征，同時(shí)又具有中醫(yī)“證”的特征。造模過(guò)程中大鼠出現(xiàn)了精神不振，攝食減少，生長(zhǎng)遲緩，身體消瘦等癥狀，與氣虛癥

31、狀相吻合。T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)提示模型組大鼠CD３、CD４降低，CD８增高，導(dǎo)致CD４與CD８比值降低，表明機(jī)體存在細(xì)胞免疫功能紊亂；造模大鼠出現(xiàn)尿纖維蛋白降解產(chǎn)物增多，表明本實(shí)驗(yàn)大鼠慢性腎炎氣虛血瘀證模型造模成功。 </p><p>　　32 黃芪的作用機(jī)理 </p><p>　　黃芪注射液是從中藥黃芪中提取而成，富含多種氨基酸和微量元素等，有益氣健脾、利水消腫的

32、作用［１１］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其具有擴(kuò)張血管，降低血壓，抗血小板凝集，增加腎血流量，改善腎臟微循環(huán)和消除過(guò)氧化脂質(zhì)作用［１２］。黃芪還能抗氧化自由基，降低自由基生長(zhǎng)，促進(jìn)自由基消除，從而保護(hù)腎組織細(xì)胞［１３］。 </p><p>　　本研究結(jié)果表明，黃芪能降低24h尿蛋白含量，降低血清BUN、SCr的水平，并呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系；能提高細(xì)胞免疫功能，降低尿FDP水平。黃芪高、低劑量組與模型組比較，系膜細(xì)胞增生現(xiàn)象均

33、有減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)消失，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)水腫明顯好轉(zhuǎn)；基底膜恢復(fù)正常，系膜區(qū)未見(jiàn)增寬，毛細(xì)血管腔受壓情況消除，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹情況減輕。本研究提示：黃芪注射液能減少尿蛋白、改善腎功能、提高細(xì)胞免疫功能、降低尿FDP，減輕腎組織病理改變，從而達(dá)到防治慢性腎炎的目的。 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn)： </b></p><p>　?。郏保蓐悘V平．大鼠Thy1抗血清

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