多拉菌素的突變生物合成及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、多拉菌素(doramectin)是由阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的bkdFGH基因缺失突變株發(fā)酵過程中添加環(huán)己羧酸產(chǎn)生的一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，為阿維菌素(avermectin)的第三代衍生物—25-環(huán)己基-5-O-脫甲基-25-脫(1-甲基丙酸)阿維菌素B1(CHC-B1)。與其它阿維菌素類產(chǎn)品比較，其抗寄生蟲范圍更廣泛、殺蟲活性更高，預(yù)防寄生蟲再感染的有效時(shí)間更長，被認(rèn)為是最有開發(fā)潛力的獸用

2、抗寄生蟲新藥。
　　 bkdFGH基因是在阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)基因組中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與阿維鏈霉菌次生代謝和分化發(fā)育密切相關(guān)的基因。bkdFGH的基因產(chǎn)物作為支鏈α-酮酸脫氫酶(Branched-chain α-keto acid dehydrogenase, BCDH)復(fù)合體的E1α亞基參與了avermectin起始單元的生物合成。bkdFGH基因缺失會(huì)導(dǎo)致阿維鏈霉菌產(chǎn)阿維菌素能力的喪失。<

3、br>　　 本文構(gòu)建了bkdFGH基因缺失載體pLJ04(pKC1139::△bkdF +△bkdH)轉(zhuǎn)化到阿維菌素高產(chǎn)菌阿維鏈霉菌76-02-e中，通過同源雙交換得到bkdFGH基因缺失突變株bkd76-3。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵及HPLC檢測，該突變株喪失產(chǎn)生阿維菌素的能力。2-甲基丁酸及異丁酸的前體添加試驗(yàn)表明，當(dāng)有外源前體存在時(shí)，突變株又能恢復(fù)阿維菌素合成的能力。環(huán)己羧酸(CHC)前體添加試驗(yàn)及HPLC檢測發(fā)現(xiàn)存在四種產(chǎn)物，經(jīng)LC/MS

4、分析驗(yàn)證，其中兩種產(chǎn)物分別為CHC-B1和CHC-A2。
　　 以bkdFGH基因缺失突變株bkd76-3為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件的研究。結(jié)果表明，有機(jī)氮源以豆餅粉和花生蛋白粉為混合氮源最佳，碳源以可溶性淀粉最佳。而測試的無機(jī)氮源中，NH4NO3在低濃度下對(duì)抗生素的合成有一定的促進(jìn)作用，其濃度在0.5g/L為最佳。同時(shí)研究了無機(jī)鹽和微量元素對(duì)于發(fā)酵的影響，最終確定了培養(yǎng)基中各種無機(jī)鹽和微量元素含量分別為MgSO4.7H2O