生物破乳劑產(chǎn)生菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及調(diào)控策略.pdf

1、為滿足“資源節(jié)約型、環(huán)境友好型”社會建設(shè)和綠色工業(yè)發(fā)展對綠色凈水劑的需求,生物破乳劑作為一種高效、低毒、環(huán)保的綠色凈水劑,成為破乳劑領(lǐng)域研究的新熱點。在高含水原油乳狀液以及其它工業(yè)乳狀液副產(chǎn)品的處理和處置中,應(yīng)用生物破乳劑替代大量使用的化學(xué)破乳劑,對提高乳狀液脫水率,降低環(huán)境污染風險具有深遠意義。但是,生物破乳劑的實際應(yīng)用進程受到破乳劑產(chǎn)生菌代謝過程不穩(wěn)定、破乳有效成分復(fù)雜及缺少大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)經(jīng)驗等問題的制約?；诖?開展破乳菌篩選方法

2、;菌種破乳效能強化;粗產(chǎn)品分離與鑒定;發(fā)酵工藝優(yōu)化及產(chǎn)破乳劑相關(guān)蛋白質(zhì)功能解析等方面的研究,將為生物破乳劑的大規(guī)模生產(chǎn)、推廣和應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。
　　將可用于間接表征生物破乳劑破乳效能及破乳菌初篩的6種生物表面活性劑檢測方法與破乳試驗相結(jié)合,提出破乳菌篩選原則,構(gòu)建高效篩選模式。確定了高效破乳菌(24h排油率≥90％)的判斷依據(jù):發(fā)酵液表面張力≤40mN/m或細胞表面疏水性(MATH)≥50%。篩選得到7株高效破乳菌,經(jīng)16S r

3、DNA鑒定分屬于芽孢桿菌屬(Bacilllus sp.)和戈登氏菌屬(Gordonia sp.),實驗室編號分別為LXH-1、LXH-2、LXH-3、LL1、LL-1、LL-2和LL-3。
　　以生物破乳劑產(chǎn)生菌XH1為研究對象,改進破乳菌復(fù)壯方法,其核心是通過烴類物質(zhì)-液體石蠟為底物排除負變細胞,調(diào)節(jié)菌株的破乳活性;改進的復(fù)壯方法可成功將菌株XH1的表面活性、破乳功能等特性恢復(fù)至原始水平,效果優(yōu)于常規(guī)復(fù)壯。
　　研究表明烴

4、類物質(zhì)-液體石蠟對菌株XH1合成破乳有效組分具有刺激和促進作用,利用液體石蠟預(yù)先刺激強化菌種,再經(jīng)生產(chǎn)培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),獲得的生物破乳劑可將破乳半衰期t1/2從16h縮短為2h。根據(jù)胞外蛋白破乳比活性、細胞表面疏水性等相關(guān)試驗結(jié)果,初步分析液體石蠟強化促進菌株XH1破乳特性的作用機制。
　　菌株XH1經(jīng)液體石蠟強化后,破乳有效組分主要分布于上清液和附著在菌體表面。分離得到生物破乳劑粗產(chǎn)品,產(chǎn)量為2.01g/L,4mg的排油率(24h

5、R.D.)>93%。利用可見-紫外光譜、紅外光譜和薄層層析(TLC)確定粗產(chǎn)品主要功能組分為蛋白質(zhì)和脂肽類物質(zhì);平均分子量為2.59×106Da。并從中粗提得到脂肽類物質(zhì)的量為0.08±0.01g/g(24hR.D.:65.3%);破乳活性蛋白復(fù)合物可由飽和度25%,45%的(NH4)2SO4粗提得到,產(chǎn)量為0.36±0.02g/g(24hR.D.:67.4%)。利用SDS-PAGE電泳和質(zhì)譜技術(shù)確定疏水蛋白質(zhì)Oxalate Decar

6、boxylase為一種破乳有效蛋白質(zhì)。
　　為了提高生物破乳劑的產(chǎn)率,采用響應(yīng)面法(RSM)確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成為:8.5g/L葡萄糖、3%(v/v)液體石蠟、15g/L磷酸鹽(K2HPO4&KH2PO4)、1.5g/L酵母膏和3.36g/L氯化銨;與優(yōu)化前相比排油率(24h)提高了35.5%,破乳劑粗產(chǎn)品產(chǎn)量提高了1倍。進一步確定最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度29℃、搖床轉(zhuǎn)速200r/min、培養(yǎng)時間21h和種子液菌齡24h。
　

7、　為了確定破乳菌XH1的發(fā)酵方式,首先基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程及Luedeking-Piret-Like方程建立描述菌株XH1分批發(fā)酵生產(chǎn)破乳劑的動力學(xué)模型,經(jīng)檢驗該組模型能較好的擬合XH1發(fā)酵過程。進一步比較不同的發(fā)酵方式,結(jié)果表明分批補料半連續(xù)式發(fā)酵優(yōu)于分批發(fā)酵,最佳補料參數(shù):初始葡萄糖為2.0g/L;補料方式為間歇式,間隔時間為5h;補料量為:控制每次補料量比前一次增加0.02%～0.04%。破

8、乳菌XH1在最佳補料方式下破乳劑粗產(chǎn)品產(chǎn)率提高55.9%,產(chǎn)品對糖得率提高44%,高效破乳劑(24h排油率>80%)連續(xù)生產(chǎn)周期延長了50h。
　　為了確定參與生物破乳劑合成的相關(guān)蛋白質(zhì),采用SDS-PAGE電泳研究液體石蠟刺激強化培養(yǎng)和單一營養(yǎng)物質(zhì)缺失對XH1破乳效能和菌體總蛋白變化的影響,獲得差異表達蛋白復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。通過nano ESI-Q-TOFMS/MS共鑒定出66個差異表達蛋白質(zhì),分屬于碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝、能量

9、產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換、翻譯/核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成等14個蛋白質(zhì)功能。確定以上差異表達蛋白質(zhì)中與糖酵解途徑(EMP)、三羧酸循環(huán)(TCA)以及蛋白質(zhì)合成相關(guān)的酶與菌株XH1合成蛋白質(zhì)和脂肽類生物破乳劑關(guān)系密切,進一步從蛋白質(zhì)組層面分析不同發(fā)酵條件影響菌株XH1產(chǎn)生物破乳劑能力的作用機制。
　　基于以上研究結(jié)果,建立發(fā)酵工藝條件、差異蛋白質(zhì)功能以及生物破乳劑合成過程三者的關(guān)系,從代謝調(diào)節(jié)、菌種特性和發(fā)酵工藝三個層面綜合分析強化破乳菌XH1產(chǎn)破乳