柑橘綠霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化和抑霉唑抗性分子機(jī)制研究.pdf

1、柑橘綠霉菌(Penicillium digitatum)是引起貯藏期柑橘腐爛最重要的一種病原。本研究首次建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘綠霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化效率達(dá)十萬分之一,所獲的突變體多為隨機(jī)單拷貝插入突變。該體系的建立有助于柑橘綠霉菌基因功能研究的開展。
　　 在評(píng)價(jià)柑橘綠霉菌對(duì)抑霉唑的抗性及其抗性分子機(jī)制時(shí),發(fā)現(xiàn)一種抗性機(jī)制尚未報(bào)道的抑霉唑抗性菌系。比較7個(gè)抑霉唑敏感菌株和14個(gè)抑霉唑抗性菌株的甾醇-14α-脫甲基酶基因(P

2、dCYP51,抑霉唑的靶標(biāo)基因)編碼區(qū)的氨基酸序列和PdCYP51基因上游啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列,均未發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的點(diǎn)突變。本研究從建立的柑橘綠霉菌的EST庫中搜索另兩個(gè)個(gè)CYP51基因,稱之為PdCYP51B和PdCYP51C。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,2個(gè)抑霉唑敏感和7個(gè)未知抑霉唑抗性菌株間3個(gè)CYP51基因(PdCYP51、PdCYP51B和PdCYP51C)的本底表達(dá)水平無顯著性差異。由此推斷未知抗性機(jī)制的抑霉唑與PdCYP5

3、1編碼區(qū)和上游啟動(dòng)子區(qū)的突變無關(guān),也與這3個(gè)CYP51基因的表達(dá)水平無關(guān)。
　　 本研究克隆了柑橘綠霉菌的一個(gè)促擴(kuò)散超家族基因PdMfs1。該基因含有一個(gè)1,876 bp的開放閱讀框(ORF),含有3個(gè)大小分別為55 bp,49 bp和71 bp的內(nèi)含子,編碼566個(gè)氨基酸,與MFS運(yùn)輸?shù)鞍字械腄HA14家族蛋白高度同源。表達(dá)分析表明PdMfs1的表達(dá)與抑霉唑抗性水平呈正相關(guān),但表達(dá)水平間的差異遠(yuǎn)低于抗性水平間的差異。抑霉唑等殺

4、菌劑均能誘導(dǎo)抑霉唑抗性和敏感菌株的PdMfs1基因表達(dá)上升。PdMfs1基因在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中異源表達(dá)能顯著提高酵母菌對(duì)DMIs類殺菌劑及其他不相關(guān)毒性化合物的抗性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),將PdMfs1基因功能缺失能顯著地降低柑橘綠霉菌對(duì)抑霉唑的抗性,但未能降低到與敏感菌株可比的水平;將PdMfs1基因重新插入到PdMfs1缺失突變體(△PdMfs1)中,能恢復(fù)該缺失菌株對(duì)抑霉唑等藥物抗性;過表