酵母菌py-1的發(fā)酵條件研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))</p><p>　題 目：酵母菌PY-1的發(fā)酵條件研究</p><p>　學(xué) 院：</p><p>　學(xué)生姓名：</p><p>　專(zhuān) 業(yè)：生物科學(xué)</p><p>　班 級(jí)：</p><p>　指導(dǎo)教師：</p>

2、<p>　起止日期：</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘 要Ⅰ</b></p><p>　　AbstractⅡ</p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>

3、　　2 材料與方法3</b></p><p><b>　　2.1菌種3</b></p><p><b>　　2.2培養(yǎng)基3</b></p><p>　　2.3 主要試劑與設(shè)備3</p><p>　　2.3.1 主要試劑3</p><p>　　2.3.2

4、設(shè)備3</p><p><b>　　2.4 方法4</b></p><p>　　2.4.1 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)4</p><p>　　2.4.2 蛋白的表達(dá)4</p><p>　　2.4.3 制備平板培養(yǎng)基4</p><p>　　2.4.4發(fā)酵液的制備4</p><p&g

5、t;　　2.4.5 抑菌活性測(cè)定4</p><p>　　2.4.6發(fā)酵單因素試驗(yàn)4</p><p>　　2.4.7 正交試驗(yàn)5</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析6</b></p><p>　　3.1 發(fā)酵單因素試驗(yàn)6</p><p>　　3.1.1 不同溫度下的抑菌活性6&l

6、t;/p><p>　　3.1.2 不同培養(yǎng)時(shí)間下的抑菌活性7</p><p>　　3.1.3 不同接種量下的抑菌活性6</p><p>　　3.1.4 不同pH值下的抑菌活性8</p><p>　　3.2 發(fā)酵正交試驗(yàn)9</p><p><b>　　4 討論16</b></p>

7、<p><b>　　5 小結(jié)17</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)18</b></p><p><b>　　致謝20</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　[摘要]：為了探索能夠抑制溶藻弧菌的

8、菌株，從實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種篩選到一株對(duì)溶藻弧菌有抑制作用的酵母菌PY-1，以該菌作為出發(fā)菌株進(jìn)行發(fā)酵條件研究。通過(guò)單因素試驗(yàn)研究該菌株的培養(yǎng)條件（接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間）。并從單因素試驗(yàn)中選取四個(gè)因素的合適水平進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，從中得到菌株P(guān)Y-1的搖床培養(yǎng)的最佳條件為：初始pH 8.0，接種量為1%，在25℃下培養(yǎng)3d。結(jié)果表明：在此條件下發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌圈最大，抑菌效果最佳。</p>

9、;<p>　　[關(guān)鍵詞]：發(fā)酵條件；酵母菌PY-1；抑菌 </p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Yeast PY-1 the conditions of fermentation of research</p><p>　　[Abstract] In order to explore the

10、 algae which can inhibit Vibrio alginolyticus, the bacteria selecting from laboratory preservation to dissolve a strain on the algae have inhibited vibrio yeast cells PY-1, with the bacteria strains of the fermented cond

11、itions as research. By single factor experiment study of the fungus culture conditions (quantity, pH value, culture temperature, cultured time). And from the single factor experiment selection in four factors for the fou

12、r factors of the appropria</p><p>　　[Keywords] Fermentation conditions; Yeast PY-1; antibacterial </p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) 屬于弧菌科(Vibrion

13、aceae) ，弧菌屬(Vibrio) ，革蘭氏陰性短桿菌，無(wú)芽孢、莢膜，單獨(dú)存在或尾端相連成“C”或“S”形，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧海生弧菌,適宜溫度17～35℃[1]。</p><p>　　溶藻弧菌廣泛分布于世界各地海水及河口處[2]，并且數(shù)量居海水類(lèi)弧菌之首[3]，但其為嗜溫菌，從夏季到冬季，由赤道向兩極隨著溫度的降低其數(shù)量也明顯減少[4,5]。另外，溶藻弧菌也大量分布在海洋動(dòng)物中[6]，如意大利亞德里亞海

14、海域采集的紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)，其中分離出的溶藻弧菌占弧菌總數(shù)的1/3左右。</p><p>　　溶藻弧菌為海洋中正常菌群之一，存在于多種海洋動(dòng)物中，是魚(yú)、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的條件致病菌。溶藻弧菌為嗜溫菌，其對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的致病性多發(fā)生在夏季[7]，在水溫25～32℃下容易流行[8]，另外動(dòng)物體免疫機(jī)能下降或環(huán)境惡化時(shí)也容易發(fā)生，如臺(tái)灣一些學(xué)者研究了蝦在氨氮(1.10～21.

15、60mg/L)[9]、亞硝氮(1.12～21.40mg/L)[10]、Cu2+ (1～20mg/L)[11]脅迫下對(duì)溶藻弧菌的敏感情況，結(jié)果表明蝦的免疫力降低、死亡率升高。此外溶藻弧菌對(duì)人的致病性也有大量報(bào)道，可引起人食物中毒[12]、耳炎[13]等等。</p><p>　　溶藻弧菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成的危害，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖戶(hù)的收入，因此如何有效的控制溶藻弧菌已經(jīng)十分迫切。國(guó)外對(duì)溶藻弧菌的研究很多，并采取多種方法防治。目

16、前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有人發(fā)現(xiàn)利用乳酸桿菌等可以起到對(duì)溶藻弧菌有抑制作用。</p><p>　　王軍等[14]人在大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea) 病原弧菌的拮抗放線菌篩選和人工誘變基礎(chǔ)上，選擇出對(duì)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus) 同時(shí)具有較強(qiáng)拮抗作用的4 株放線菌。采用瓊脂塊法測(cè)定4株放線菌的抗菌譜，并檢測(cè)4株放線菌分別在固體和液體

17、培養(yǎng)液中的拮抗作用。結(jié)果表明：4株放線菌的抗菌譜均較窄，在固體和液體培養(yǎng)基中對(duì)2 種病原弧菌都有較強(qiáng)的拮抗作用。</p><p>　　徐長(zhǎng)安[15]等人自海灘污泥中分離出一株海洋生境枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LHB02，其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)海水養(yǎng)殖常見(jiàn)致病菌弧菌有很強(qiáng)拮抗能力。采用硫酸銨沉淀、Sephadex G-50凝膠層析等方法，進(jìn)一步對(duì)LHB02發(fā)酵產(chǎn)物分離純化，獲得了分子質(zhì)量為47ku單一

18、條帶的糖蛋白。經(jīng)抗菌活性分析及穩(wěn)定性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，純化后的抗菌蛋白對(duì)哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)熱穩(wěn)定及酸的耐受性也比較強(qiáng)(pH 3.0~8.0)，但對(duì)部分蛋白酶敏感。LHB02所產(chǎn)抗菌蛋白的強(qiáng)抑菌作用和高穩(wěn)定性，預(yù)示著該菌可作為一種生防細(xì)菌開(kāi)發(fā)，用于大黃魚(yú)養(yǎng)殖中弧菌病的防治。</p><

19、;p>　　蘇浩等[16]人采用牛津杯抑菌圈檢測(cè)法，探討了4 株芽孢桿菌( K、S、BA、SN) 代謝產(chǎn)物對(duì)溶藻弧菌的抑制能力，用三角燒瓶稀釋法模擬養(yǎng)殖水體，探討了枯草芽孢桿菌SN 對(duì)溶藻弧菌的抑制效果。結(jié)果顯示，K、S、BA 沒(méi)有抑菌活性，SN 有明顯抑菌活性，在模擬養(yǎng)殖水體中，104～l06cfu/ml 的SN 溶液對(duì)溶藻弧菌有明顯的抑制作用，其抑制作用隨溶藻弧菌菌量的增大而減弱。進(jìn)一步嘗試用SN 培養(yǎng)液來(lái)控制鮑養(yǎng)殖池中底棲硅藻

20、上弧菌的數(shù)量，104 cfu/ml 的SN 對(duì)弧菌有較好的抑制作用。</p><p>　　楊鶯鶯等[17]人以溶藻弧菌T1和鯊魚(yú)弧菌T2為檢測(cè)菌，采用平板抑菌圈檢測(cè)法，研究乳酸桿菌L1及其代謝產(chǎn)物的抑菌能力。結(jié)果表明：L1發(fā)酵上清液對(duì)兩種弧菌的抑制效果和發(fā)酵液對(duì)弧菌的抑菌作用相似，即對(duì)弧菌T1的抑制作用強(qiáng)于T2；L1發(fā)酵液對(duì)弧菌T1、T2的抑制能力強(qiáng)于上清液，表明乳酸桿菌及其代謝物質(zhì)對(duì)弧菌具有協(xié)同抑制作用；L1的

21、發(fā)酵液經(jīng)3倍稀釋仍對(duì)弧菌T1有抑制作用；乳酸桿菌L1生長(zhǎng)不同時(shí)期的代謝產(chǎn)物對(duì)弧菌的抑菌活性不同，代謝產(chǎn)物的抑菌能力在衰退期>穩(wěn)定期>生長(zhǎng)期；L1的發(fā)酵液經(jīng)沸水浴處理15min。其抑菌活性不變，表明抑菌代謝物質(zhì)具有較好的耐熱性。</p><p>　　本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是酵母菌PY-1，其是浙江海洋學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從舟山海域土壤樣品中分離得到的，研究表明該菌對(duì)溶藻弧菌（V.alginolyticus）具有較

22、強(qiáng)的抑制作用，通過(guò)對(duì)菌株P(guān)Y-1發(fā)酵條件的研究，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1菌種</b></p><p>　　酵母菌PY-1由實(shí)驗(yàn)室保存并提供；溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）作為指示菌購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CG

23、MCC）</p><p><b>　　2.2培養(yǎng)基</b></p><p>　　YPD液體培養(yǎng)基：酵母浸出液10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，溶解于1LddH2O中，調(diào)PH值為6.5。115℃滅菌20min。</p><p>　　營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂15.0g-20.0g，蒸餾水1000mL

24、，pH7.4-7.6，121℃高壓蒸汽滅菌20min。</p><p>　　YSD培養(yǎng)基：Yeast Nitrogen Base 6.7 g/L，葡萄糖20 g/L，亮氨酸200 mg/L，腺嘌呤100 mg/L，肌醇200 mg/L，112 ℃滅菌20 min。</p><p>　　YSD 固體培養(yǎng)基：100 mL YSD 培養(yǎng)液加瓊脂粉1.5 g。</p><p&g

25、t;　　2.3 主要試劑與設(shè)備</p><p>　　2.3.1 主要試劑</p><p>　　5%的NaOH溶液：稱(chēng)取5g氫氧化鈉溶于100mL水中。</p><p><b>　　2.3.2 設(shè)備</b></p><p>　　低速離心機(jī) 型號(hào)：LD5-2B，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司</p><p>

26、;　　上皿電子天平 型號(hào)：FA2004，上海精科天平有限公司</p><p>　　超凈工作臺(tái) 型號(hào)：HT-CJ-1，安徽航天生物科技有限公司</p><p>　　恒溫振蕩器 型號(hào)：THZ-C，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠</p><p>　　恒溫培養(yǎng)搖床 型號(hào)：THZ-103B，上海一恒科學(xué)儀器有限公司</p><p>　　恒溫培養(yǎng)振蕩器 型號(hào)：NS

27、KY-100B，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司</p><p>　　分體落地式空調(diào)器 型號(hào)：分體落地式KFR-12，廣東順德美的冷氣機(jī)制造有限公司</p><p>　　智能人工氣候箱 型號(hào)：RXZ，寧波江南儀器制造</p><p>　　電冰箱 型號(hào)：海爾：BCD-257，青島海爾股份有限公司</p><p>　　馬頭牌架盤(pán)藥物天平 型號(hào)：BP-II，上

28、海醫(yī)用激光儀器廠</p><p>　　電子天平 型號(hào)：BS124S型，塞多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司</p><p>　　立式壓力蒸汽滅菌器 型號(hào)：LAZX-75KB 上海申安醫(yī)療器械廠</p><p>　　此外還需電爐，錐形瓶，玻璃棒，移液槍?zhuān)囵B(yǎng)皿，燒杯，打孔器等。</p><p><b>　　2.4 方法</b>

29、</p><p>　　2.4.1 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)</p><p>　　對(duì)篩選出的酵母菌PY-1進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將細(xì)胞懸浮液涂于YSD板上，30℃培養(yǎng)4-6天。</p><p>　　2.4.2 蛋白的表達(dá)</p><p>　　挑取YSD板上直徑為0.5-1mm菌斑于3mLYSD溶液中擴(kuò)大培養(yǎng)12h，然后以1：25的比例轉(zhuǎn)入50mLYSD溶液中，30

30、℃，250轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)12小時(shí)；最后以1：25的比例轉(zhuǎn)入1LYPD溶液中，30℃，250轉(zhuǎn)/min擴(kuò)大培養(yǎng)3-4天。開(kāi)始發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.4.3 制備平板培養(yǎng)基</p><p>　　實(shí)驗(yàn)前制備好營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基并滅菌。實(shí)驗(yàn)時(shí)待錐形瓶表面溫度不燙手時(shí),每50mL培養(yǎng)基中加入100μL溶藻弧菌，倒好平板，在水平臺(tái)上靜置一段時(shí)間。</p><p>　　2

31、.4.4發(fā)酵液的制備</p><p>　　挑取目標(biāo)菌株接種于對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，按照50mL/250mL裝瓶量在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物用低速離心機(jī)在4000r/min進(jìn)行離心，取上清液測(cè)定抑菌活性[18,19,20,21]。</p><p>　　2.4.5 抑菌活性測(cè)定（瓊脂擴(kuò)散法）</p><p>　　選用特定的打孔器，將蘸有酒精的打孔器在酒精燈上點(diǎn)

32、燃后立即移開(kāi)，待酒精燃燒完全后即達(dá)到滅菌效果。利用瓊脂擴(kuò)散法[22,23,24,25]在加有指示菌的培養(yǎng)基上利用移液槍向每個(gè)孔洞中注入50ul的液體，其中一個(gè)孔洞做空白對(duì)照，35℃培養(yǎng)1d，觀察結(jié)果并測(cè)定抑菌圈的大小。其中以溶藻弧菌作為指示菌。</p><p>　　2.4.6發(fā)酵單因素試驗(yàn)</p><p>　　2.4.6.1 最適溫度的選擇[26]</p><p>

33、　　以2%接種量，接種于裝有50mLYPD液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，分別以25℃、28℃、30℃、35℃為培養(yǎng)溫度，250轉(zhuǎn)/min，pH6.5，培養(yǎng)3d，利用瓊脂擴(kuò)散法分別測(cè)定抑菌圈直徑。</p><p>　　2.4.6.2 最適培養(yǎng)時(shí)間選擇[27]</p><p>　　以2%接種量，接種于裝有50mLYPD液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃，250轉(zhuǎn)/min，pH6.5，分別

34、以3d、5d、6d、7d、8d，利用瓊脂擴(kuò)散法分別測(cè)定抑菌圈直徑。</p><p>　　2.4.6.3 最適接種量選擇[28]</p><p>　　分別以1%、2%、5%、8%為接種量，接種于裝有50mLYPD液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃，250轉(zhuǎn)/min，pH6.5，培養(yǎng)3d，用瓊脂擴(kuò)散法分別測(cè)定抑菌圈直徑。</p><p>　　2.4.6.4 最適pH

35、值選擇[29]</p><p>　　以2%接種量，接種于裝有50mLYPD液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃，250轉(zhuǎn)/min，pH分別控制在5.5、6.5、7.5、8.0，培養(yǎng)3d，利用瓊脂擴(kuò)散法分別測(cè)定抑菌圈直徑。</p><p>　　2.4.7 正交試驗(yàn)</p><p>　　根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用4因素3水平L9（34）正交表[30,31,32,33]對(duì)

36、發(fā)酵溫度、酵母接種量、培養(yǎng)時(shí)間、pH等4個(gè)因素進(jìn)行正交組合，在培養(yǎng)基上加入溶藻弧菌作為指示菌，以抑菌圈的直徑為指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。 </p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 發(fā)酵單因素試驗(yàn)</p><p>　　注：發(fā)酵單因素試驗(yàn)所用打孔器直徑：6.11mm，所測(cè)抑菌圈直徑單位：mm。發(fā)酵培養(yǎng)

37、時(shí)間（除培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)外）都是3d。</p><p>　　3.1.1 不同溫度下的抑菌活性</p><p>　　不同溫度對(duì)菌株P(guān)Y-1抑菌效果的影響如表1所示，培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)抑菌效果最佳，隨著溫度的上升抑菌圈直徑變小，抑菌效果減弱。</p><p>　　表3.1 不同溫度下的抑菌圈直徑</p><p>　　Tab.3.1 under dif

38、ferent temperature of antibacterial of circle diameter</p><p>　　圖3.1不同溫度對(duì)抑菌效果的影響</p><p>　　Fig.3.1 different temperature on antibacterial effect</p><p>　　圖3.2 不同溫度條件下的抑菌圈直徑</p>

39、<p>　　Fig.3.2 different temperature condition of antibacterial of circle diameter</p><p>　　3.1.2 不同培養(yǎng)時(shí)間下的抑菌活性</p><p>　　不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株P(guān)Y-1抑菌效果的影響如表2所示，并結(jié)合抑菌圈直徑測(cè)定的結(jié)果，培養(yǎng)時(shí)間3d后發(fā)酵液的抑菌效果達(dá)到最高，超過(guò)3d后，隨著

40、時(shí)間的增加，抑菌效果逐漸減弱，到7d,8d的時(shí)候抑菌效果幾乎沒(méi)有。</p><p>　　圖3.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果影響</p><p>　　Fig.3.3 different training time on the influence that the antibacterial effect</p><p>　　表3.2 培養(yǎng)3d的抑菌圈直徑</p&

41、gt;<p>　　Tab.3.2 3 days training antibacterial circle diameter</p><p>　　表3.3 培養(yǎng)5d的抑菌圈直徑</p><p>　　Tab.3.3 5 days training antibacterial circle diameter</p><p>　　圖3.4 培養(yǎng)5d時(shí)抑菌圈的

42、直徑</p><p>　　Fig.3.4 5 days training antibacterial circle diameter</p><p>　　表3.4 培養(yǎng)6d的抑菌圈直徑</p><p>　　Tab.3.4 6 days training antibacterial circle diameter</p><p>　　圖3.5

43、培養(yǎng)6d時(shí)抑菌圈的直徑</p><p>　　Fig.3.5 6 days training antibacterial circle diameter</p><p>　　按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃設(shè)計(jì)了7d和8d的培養(yǎng)時(shí)間，但試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)7d和8d的試驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)抑菌圈出現(xiàn)。</p><p>　　3.1.3 不同接種量下的抑菌活性</p><p>　

44、　不同接種量對(duì)菌株P(guān)Y-1抑菌效果的影響如表3所示，1%-2%接種量時(shí)抑菌圈直徑逐漸升高，隨著接種量的繼續(xù)增加，抑菌圈直徑變小，這可能與接種量過(guò)高導(dǎo)致發(fā)酵液的菌株提前衰亡所致。</p><p>　　表3.5 不同接種量下的抑菌圈直徑</p><p>　　Tab.3.5 under different quantity of antibacterial of circle diameter&

45、lt;/p><p>　　圖3.7 不同接種量對(duì)抑菌效果的影響</p><p>　　Fig.3.7 different quantity of antibacterial effect</p><p>　　圖3.8 不同接種量下的抑菌圈直徑</p><p>　　Fig.3.8 different quantity of antibacterial

46、circle diameter</p><p>　　3.1.4 不同pH值下的抑菌活性</p><p>　　不同PH對(duì)菌株P(guān)Y-1抑菌效果的影響如表4所示，在pH6.5時(shí)，抑菌圈直徑最高，pH7.5的時(shí)候次之。</p><p>　　表3.6 不同pH下的抑菌圈的大小</p><p>　　Tab.3.6 under different pH o

47、f antibacterial of the size of the circle</p><p>　　圖3.9 不同pH對(duì)抑菌效果的影響</p><p>　　Fig.3.9 different pH of antibacterial effect</p><p>　　圖3.10 不同pH下的抑菌圈直徑</p><p>　　Fig.3.10

48、different pH of antibacterial circle diameter</p><p>　　3.2 發(fā)酵正交試驗(yàn)</p><p>　　注：發(fā)酵正交試驗(yàn)所用打孔器直徑：6.11mm。</p><p>　　為了考察不同培養(yǎng)條件對(duì)抑菌效果的影響，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)如下表5所示。</p><p>　　表3.7 菌株P(guān)Y-

49、1培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)的因素水平</p><p>　　Tab.3.7 strains PY-1 culture conditions of the orthogonal experiment factors level</p><p>　　表3.8 菌株P(guān)Y-1培養(yǎng)條件正交設(shè)計(jì)表L9（34）</p><p>　　Tab.3.8 Strains PY-1 cultiva

50、tion condition orthogonal design table then L9 (34)</p><p>　　圖3.11 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)1 圖3.12 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)2</p><p>　　Fig.3.11 orthogonal experiment test number 1 Fig.3.12 orthogonal experime

51、nt test number 2</p><p>　　圖3.13 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)3 圖3.14 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)4</p><p>　　Fig.3.13 orthogonal experiment test number 3 Fig.3.14 orthogonal experiment test number 4</p><p&

52、gt;　　圖3.15 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)5 圖3.16 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)6</p><p>　　Fig.3.15 orthogonal experiment test number 5 Fig.3.16 orthogonal experiment test number 6</p><p>　　圖3.17 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)7

53、 圖3.18 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)8</p><p>　　Fig.3.17 orthogonal experiment test number 7 Fig.3.18 orthogonal experiment test number 8</p><p>　　圖3.19 正交試驗(yàn)試驗(yàn)號(hào)9</p><p>　　Fig.3.19 orthogonal experim

54、ent test number 9</p><p>　　對(duì)R值分析如表6所示，四個(gè)因素影響作用的大小應(yīng)為A>B>D>C，理論培養(yǎng)優(yōu)化方案為A1B1C3D1。培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為：培養(yǎng)溫度為25℃，接種量為1%，發(fā)酵的pH為8.0，培養(yǎng)時(shí)間為3d。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　抗菌活性菌株是指

55、那些在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生抑菌或殺菌活性物質(zhì)的微生物，通常利用抗生素測(cè)定的方法給予檢出?？咕股氐臏y(cè)定主要有稀釋法、比濁法和擴(kuò)散法。擴(kuò)散法是利用藥物在瓊脂中擴(kuò)散使其周?chē)闹甘揪L(zhǎng)受到抑制而形成抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小來(lái)判斷抗菌活性。擴(kuò)散法包括了紙片法、管碟法、點(diǎn)滴法等多種方法。本試驗(yàn)采用的瓊脂擴(kuò)散法是一種抗菌活性菌株快速簡(jiǎn)便的初步篩選方法，在瓊脂培養(yǎng)基上直接注入發(fā)酵液，使其在瓊脂中擴(kuò)散加入指示菌后測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的大小判斷最

56、佳抑菌效果的發(fā)酵條件。</p><p>　　目前，據(jù)相關(guān)論文報(bào)道能夠抑制溶藻弧菌生長(zhǎng)的微生物為放線菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌等[14,15,16,17]，但是多數(shù)都停留在實(shí)驗(yàn)室研究中，投入生產(chǎn)上的微生物菌種寥寥無(wú)幾。相比之下，酵母菌PY-1更易培養(yǎng)和擴(kuò)大生產(chǎn)。因?yàn)榫關(guān)Y-1從最適發(fā)酵工藝條件上看，最佳抑菌效果的初始pH 值為8.0，接種量為1%，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時(shí)間為3d，該發(fā)酵工藝條件在普通發(fā)酵工廠或車(chē)間完

57、全可以實(shí)現(xiàn)而易控制。因此，改進(jìn)酵母菌PY-1的發(fā)酵工藝和抑菌活性物質(zhì)的濃度仍是繼續(xù)研究的主要課題任務(wù)之一。</p><p><b>　　5 小結(jié)</b></p><p>　　發(fā)酵條件對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率有重要的影響, 如何合理優(yōu)化發(fā)酵條件，提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，是能否進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的先決條件。本研究利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法,對(duì)分離得到的酵母菌PY-1進(jìn)行

58、培養(yǎng)條件的優(yōu)化,并得出最適發(fā)酵條件,也為酵母菌PY-1的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。此外，通過(guò)本次研究，對(duì)如何進(jìn)行發(fā)酵條件的影響有了一定的了解，對(duì)以后的工作很有幫助。</p><p>　　不同的環(huán)境條件對(duì)微生物的生長(zhǎng)會(huì)有不同的影響，特別是溫度的影響，它不僅對(duì)菌株的個(gè)體生長(zhǎng)具有重要的意義，而且也決定了其一系列的酶促反應(yīng)的速率，并會(huì)影響一些代謝產(chǎn)物的活性。本研究結(jié)果顯示，在溫度為25℃時(shí)，菌株P(guān)Y-1的發(fā)酵液有最佳的抑菌

59、活性，最佳的發(fā)酵溫度為25℃。</p><p>　　不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物的生長(zhǎng)及活性物質(zhì)的產(chǎn)生也有很大的影響。在工業(yè)化生長(zhǎng)中，若發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則代謝廢物增加，增加活性物質(zhì)提純難度，生產(chǎn)成本提高；若發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，則活性產(chǎn)物的合成過(guò)少，影響產(chǎn)量。本研究結(jié)果顯示菌株P(guān)Y-1的最佳培養(yǎng)時(shí)間為3d。</p><p>　　pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響是通過(guò)影響其機(jī)體的酶促反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，適宜的pH值可以提

60、高酶促反應(yīng)的速率。本研究結(jié)果顯示在pH6.5時(shí)，菌株具有最佳的抑菌效果。</p><p>　　在搖瓶實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)椴荒軐?duì)發(fā)酵培養(yǎng)持續(xù)供氧，所以不同的接種量對(duì)發(fā)酵液活性具有很大的影響。在給定的培養(yǎng)基條件下，接種量大小對(duì)菌株的生長(zhǎng)周期有很大的影響。本研究結(jié)果顯示，菌株P(guān)Y-1的最佳接種量為2%。</p><p>　　目前本研究只研究了溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、接種量四個(gè)發(fā)酵條件，而實(shí)際上發(fā)酵條件不僅

61、僅受這四個(gè)條件影響，還有受很多因素影響。所以在以后的研究中應(yīng)增加其他發(fā)酵條件的研究，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行更深入的分析，以期為酵母菌PY-1的發(fā)酵條件優(yōu)化提供充實(shí)的理論依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Stefan H，Helmut W，Karin N B，et al．Isolation of Vibrio alginoly

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82、懷，李老師嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的治學(xué)態(tài)度和獻(xiàn)身科學(xué)的精神使我終身受益，深深的感謝李老師對(duì)我學(xué)習(xí)、工作和生活上的諸多幫助。唯有繼續(xù)努力工作，才能不辜負(fù)李老師的教誨和殷切希望。</p><p>　　在此，謹(jǐn)向李老師致以深深的謝意！</p><p>　　同時(shí)，也感謝我的同伴李同學(xué)，在論文實(shí)施過(guò)程中給予了我很多的幫助！</p><p>　　最后，謹(jǐn)向我的李老師、曾經(jīng)幫助過(guò)我的老師和同學(xué)