產(chǎn)油脂酵母菌的遺傳改良和油脂的發(fā)酵生產(chǎn).pdf

1、近些年研究表明生物柴油是一種清潔、可降解、可再生生物能源,現(xiàn)在的引擎無需改造就可以直接使用生物油脂作為燃料,并且產(chǎn)生更少的有害氣體,環(huán)境污染和能源危機使得生物柴油備受關注。目前生物油脂的高額成本是其工業(yè)化生產(chǎn)的主要障礙。尋求廉價原料是降低生物柴油成本的關鍵。
　　 我們實驗室以前的研究中發(fā)現(xiàn)膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)TJYl5是一種產(chǎn)油脂酵母菌。以膠紅酵母(R.mucilaginosa)為實驗菌

2、種,菊粉水解液為原料,分批培養(yǎng)時該酵母細胞干重和油脂的含量分別為14.8g/L和48.8％;以菊芋根塊的水解液為底物分批發(fā)酵和分批補料發(fā)酵時該酵母細胞干重和油脂的含量分別為14.4 g/L、48.6％和19.47g/L、52.2％。對所產(chǎn)脂肪酸分析表明C16:0,C18:1和C18:2含量較高,三者之和占總脂肪酸的87.6％,說明以菊芋原料經(jīng)過該酵母轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的油脂脂肪酸組成與植物油脂脂肪酸組成類似。
　　 為了建立直接轉(zhuǎn)化菊糖生

3、產(chǎn)油脂的工藝,把季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)M-30細胞進行固定化,固定化的突變株M-30細胞與游離的膠紅酵母細胞混合培養(yǎng),研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)適合季也蒙畢赤酵母M-30包埋的最佳條件是:聚乙烯醇7％、海藻酸鈉1.4％、pH8.0、氯化鈣3％。季也蒙畢赤酵母M-30在固定化培養(yǎng)中酶活達到169.3％U/mL,對照游離細胞酶活只有124.3 U/mL。膠紅酵母和季也蒙畢赤酵母M-30聯(lián)合培養(yǎng),以菊粉、菊芋提取物為底物

4、,經(jīng)過48h混合培養(yǎng),膠紅酵母油脂和細胞干重分別為53.16％、12.24g/L;55.43％、12.83 g/L。經(jīng)過48h發(fā)酵罐混合培養(yǎng),膠紅酵母油脂產(chǎn)量達到最高值56.57％,細胞干重達到19.64 g/L,發(fā)酵培養(yǎng)的膠紅酵母細胞中的C16:0,C18:1,C18:2這三種脂肪酸占總脂肪酸的90.O％。
　　 為了建立一步發(fā)酵菊糖產(chǎn)生油脂的工藝,將來源于馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marximum)CBS

5、6556的酶基因INUl在產(chǎn)油脂解脂亞羅威亞酵母中表達:首先將菊粉酶基因INUl與表達質(zhì)粒pINA1317連接,并在產(chǎn)油脂解脂亞羅威亞酵母(Y.lipolytica)ACA-DC50109中進行了功能表達,得到了重組子Z31。Z31培養(yǎng)72 h經(jīng)測定粗酶液酶活力為41.7±0.4 U/mL。優(yōu)化了Z31的產(chǎn)油脂條件,選擇5％糖(菊芋)為碳源,氮源選擇硫酸銨和酵母膏,且C/N為350,即硫酸銨0.017％和酵母膏0.0355％,發(fā)酵78

6、h油脂達到峰值,油脂和細胞干重分別為46.3％和11.6 g/L。通過2-L發(fā)酵罐分別以菊粉和菊芋提取物為底物發(fā)酵78h菌體產(chǎn)油量分別為48.3％和50.57％,菌體干重分別達到13.3 g/L和14.63 g/L,C16:0,C18:0,C18:1這三種脂肪酸占總脂肪的91.5％。重組油脂酵母產(chǎn)油與單獨培養(yǎng)紅酵母產(chǎn)油、固定化聯(lián)合培養(yǎng)產(chǎn)油相比,產(chǎn)油含量和細胞干重相似,從而建立了利用重組油脂酵母菌一步轉(zhuǎn)化菊糖和菊芋根塊提取液產(chǎn)生油脂的工藝