海洋季也蒙畢赤酵母菌油脂合成調(diào)控的研究.pdf

1、微生物油脂是制備生物柴油的新原料,已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。目前微生物油脂發(fā)酵的成本太高限制了它的工業(yè)化應(yīng)用。其中原因,一是傳統(tǒng)的微生物油脂生產(chǎn)主要以葡萄糖或淀粉質(zhì)糧食作為原料;二是油脂微生物利用碳水化合物轉(zhuǎn)化為油脂的轉(zhuǎn)化效率還較低。所以,進(jìn)一步研究微生物油脂合成調(diào)控機(jī)制并提高油脂的合成效率,以及開(kāi)發(fā)新的非糧食原料具有重要的理論及應(yīng)用意義。
　　我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),菊糖這種非糧食材料比較適合替代傳統(tǒng)原料進(jìn)行油脂發(fā)酵。然而在目前的油脂微

2、生物中很少具有分泌菊糖酶的菌株。本研究從海洋環(huán)境篩選到1株具有菊糖酶活力而且能夠合成高水平油脂的Pcla22酵母菌株。綜合細(xì)胞形態(tài)、菌落特征、生理生化和26S rDNA分子特征,將其鑒定為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)。
　　采用高油脂水平的Pcla22菌株直接轉(zhuǎn)化菊糖合成油脂,省去了菊糖水解預(yù)處理過(guò)程,簡(jiǎn)化了發(fā)酵工藝,這對(duì)降低微生物油脂生產(chǎn)成本以及菊糖的高效利用具有重要意義。據(jù)此,測(cè)試了 Pcla2

3、2菌株對(duì)菊糖的利用能力,其菊糖酶活力為11.5 U/ml。優(yōu)化了發(fā)酵菊糖的發(fā)酵條件。在補(bǔ)料發(fā)酵條件下,發(fā)酵96 h后,其菌體生物量達(dá)到20.4 g/l,胞內(nèi)油脂水平達(dá)到60.6％(w/w),糖轉(zhuǎn)化為油脂的得率達(dá)到0.19 g/g。分析了油脂中脂肪酸成分,油酸和棕櫚酸的含量超過(guò)了79.8%,其中油酸占到全部脂肪酸的57.9%。利用此菌株油脂制備了生物柴油,其生物柴油轉(zhuǎn)化率高達(dá)84.3%,而且燃燒性能良好。
　　季也蒙畢赤酵母菌株TJ

4、Y22和Pcla22的油脂累積水平差別很大,相同條件下,TJY22菌株胞內(nèi)油脂僅為19.4%(w/w),而Pcla22菌株則高達(dá)49.0%(w/w)。利用熒光定量 PCR方法檢測(cè)了這兩株油脂代謝相關(guān)的多個(gè)基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)TJY22菌株中丙酮酸羧化酶基因的表達(dá)水平非常低,僅為Pcla22菌株的7.6%。表明較低的丙酮酸羧化能力可能成為該菌株油脂合成的限速步驟。采用在培養(yǎng)基中添加CaCO3的方法提高了TJY22菌株的丙酮酸羧化反應(yīng),發(fā)現(xiàn)C

5、aCO3不僅提高了胞內(nèi)丙酮酸羧化酶活力,也提高了TJY22菌株胞內(nèi)油脂水平。
　　將季也蒙畢赤酵母菌的丙酮酸羧化酶基因(PYC)和解脂耶羅維亞酵母菌ATP檸檬酸裂解酶基因(ACL1)在解脂耶羅維亞酵母ACA-DC50109菌株中進(jìn)行了表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),野生型菌株、P77(PYC轉(zhuǎn)化子)和PA56(PYC和ACL1共轉(zhuǎn)化子)的胞內(nèi)油脂含量分別為30.2%(w/w)、38.2%(w/w)和45.3%(w/w);糖轉(zhuǎn)化為油脂的得率分別為0

6、.091 g/g、0.112 g/g和0.136 g/g;胞外檸檬酸濃度分別為0.5 g/l、11.5 g/l和6.2 g/l。表明丙酮酸羧化酶(PYC)和ATP檸檬酸裂解酶(ACL)在油脂和檸檬酸合成調(diào)控中有重要作用。丙酮酸羧化酶(PYC)促進(jìn)了檸檬酸的累積,ATP檸檬酸裂解酶(ACL)又將檸檬酸定向引入脂肪酸的合成。所以,PYC和ACL1基因的共表達(dá)能夠?qū)⒃鰪?qiáng)丙酮酸羧化反應(yīng)的碳代謝流導(dǎo)入到油脂合成,提高了碳水化合物轉(zhuǎn)化為油脂的得率,