海洋季也蒙畢赤酵母重組菊粉酶及其在產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用.pdf

1、菊粉(inulin)作為一種貯藏性碳水化合物存在于菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣(chicory)、大麗花(dahlia)和雪蓮果(yacon)等植物的根和莖中,這些植物的根和塊莖的產(chǎn)量很大,干重中含有超過70％的菊粉。菊粉(Inulin)是由β-2,1-糖苷鍵連接的D-呋喃果糖分子組成的鏈狀大分子,在還原末端有一個葡萄糖殘基以蔗糖型糖苷鍵連接。菊粉作為一種應(yīng)用于高果糖漿生產(chǎn),酒精發(fā)酵和寡菊糖生產(chǎn)的可再生原料,近來

2、受到越來越多的關(guān)注。菊粉酶(Inulinase)是一種水解酶,它作用于β-2,1-糖苷鍵并將菊粉水解為果糖和葡萄糖。
　　 我們發(fā)現(xiàn),從海藻表面分離得到的季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)菌株1(中國海洋微生物菌種保藏中心編號2E00048)能向培養(yǎng)液中分泌大量的菊粉酶。我們將海洋季也蒙畢赤酵母strain1中克隆到的菊粉酶基因INU1在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)X-33中表達(dá),并

3、優(yōu)化了產(chǎn)酶條件,實(shí)現(xiàn)了菊粉酶的超表達(dá)。產(chǎn)酶條件優(yōu)化之后,在72h 150.0 mL搖瓶培養(yǎng)之后,在培養(yǎng)液上清中得到79.8±3.5 U/mL重組菊粉酶;經(jīng)過120 h 2-L發(fā)酵罐發(fā)酵之后,在上清中獲得286.8±5.4 U/mL(比活力8873±55.3 U/mg)的重組菊粉酶。隨后我們純化了重組菊粉酶并研究了它的酶學(xué)性質(zhì)。純化的重組菊粉酶的分子量為57.6kDa,大于野生型菊粉酶。它的最適pH值和最適溫度分別為6.0和60℃。純化的

4、重組菊粉酶的其他生物化學(xué)性質(zhì)與海洋季也蒙畢赤酵母中的野生型菊粉酶相一致。純化的重組菊粉酶依然具有很高的外切活性,因此在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有廣泛的潛在應(yīng)用價值。
　　 我們已經(jīng)證實(shí),酵母菌株W0能夠發(fā)酵生產(chǎn)高濃度的酒精,但是W0不能直接利用菊粉作為發(fā)酵產(chǎn)酒精的原料。因此我們使用2-L發(fā)酵罐發(fā)酵得到的重組菊粉酶的粗酶液糖化菊粉,作為W0發(fā)酵酒精的原料。經(jīng)過150.0 mL小發(fā)酵瓶和1-L發(fā)酵體系的菊粉水解液發(fā)酵實(shí)驗(yàn),分別獲得14.9

5、±0.4％(v/v)和14.8±0.2％(v/v)的酒精產(chǎn)量。發(fā)酵液中的總糖和還原糖的殘留極少,說明菊粉已全部被水解并轉(zhuǎn)化為酒精。為了簡化酒精發(fā)酵工藝,我們對酵母菌株W0進(jìn)行了代謝改造,將海洋季也蒙畢赤酵母strain1中克隆到的菊粉酶基因INU1在酵母菌株W0的尿嘧啶缺陷突變株W101中表達(dá)。轉(zhuǎn)化子Inu-66經(jīng)過72h的培養(yǎng)能分泌33.7±0.4 U/mL的胞外菊粉酶。我們通過菊粉一步發(fā)酵產(chǎn)酒精的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),重組酶接種量為22.8 U

6、/g菊粉時最適合菊粉的水解和酒精的發(fā)酵生產(chǎn)。在150.0 mL體系中,酒精產(chǎn)量為13.7±0.5％(v/v),總糖利用率為99.1％。在2-L發(fā)酵罐中,酒精產(chǎn)量為14.9±0.6％(v/v),總糖利用率為99.5％,發(fā)酵培養(yǎng)基中的菊粉都轉(zhuǎn)化為了酒精、CO2和細(xì)胞生物量。使用重組子Inu-66在2-L發(fā)酵罐中直接發(fā)酵菊芋粉和硫酸銨配制的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酒精,酒精產(chǎn)量為12.1±0.3％(v/v),總糖利用率為90.4±0.5％(w/v),殘留