海洋季也蒙畢赤酵母菊粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)、純化、特性、基因克隆與表達(dá)的研究.pdf

1、菊粉作為植物的一種貯存性多糖，主要存在于如菊芋(或稱洋姜，Helianthustuberosus)、菊苣(Cichorium endivia)、大麗花(Dahlia pinnata)、牛蒡(Arctiumlappa)等尚未開(kāi)發(fā)利用的植物根莖中。菊粉酶是一種主要來(lái)源于微生物的多糖水解酶，它可以在一定的溫度條件下水解菊粉為果糖和低聚果糖等，其水解產(chǎn)物在食品發(fā)酵、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面都有廣泛的應(yīng)用。菊粉酶的來(lái)源廣泛，包括霉菌、酵母菌、細(xì)菌和放線菌等

2、，但是對(duì)于海洋酵母菌產(chǎn)菊粉酶的情況了解甚少，本實(shí)驗(yàn)室獲得了一株高產(chǎn)菊粉酶的海洋酵母菌strain 1，通過(guò)生物學(xué)鑒定方法確定該株海洋酵母菌屬于季也蒙畢赤酵母(Pichia. guilliermondii)。 本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)季也蒙畢赤酵母(P.guilliermondii)strain 1產(chǎn)菊粉酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)基為4％菊粉，0.5％酵母粉，初始pH值為8.0，海水配制，培養(yǎng)條件為接種量1

3、0％(v/v)(OD600nm=20.0)，最適溫度28 ℃，170 rpm培養(yǎng)，得到的最高菊粉酶活力達(dá)到了61.5U/mL。同時(shí)，對(duì)strain 1菊粉酶粗酶水解底物菊粉水解菊粉的產(chǎn)物進(jìn)行了薄層層析檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該酶能夠充分水解菊粉，得到的終產(chǎn)物以單糖為主，證明了strain 1菊粉酶具有較高的外切菊粉酶活力。 在最適產(chǎn)酶條件下培養(yǎng)，將獲得的季也蒙畢赤酵母(P.guilliermondii) strain 1胞外菊粉酶粗酶進(jìn)行超

4、濾濃縮，通過(guò)分子篩SephadexTM G-75和陰離子交換層析柱DEAE Fast Flow分離純化，純化后蛋白酶SDS-PAGE凝膠電泳顯示分子量約為50kDa。對(duì)純化后的菊粉酶進(jìn)行了一系列酶學(xué)性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)純化后的菊粉酶最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度分別為6.0和60℃，該酶對(duì)溫度不敏感，并具有熱穩(wěn)定性，對(duì)pH較敏感，只在5-7范圍內(nèi)活力穩(wěn)定。另外，很多金屬離子對(duì)純酶活力有一定程度的激活作用；當(dāng)存在Hg2+、Mg2+、Ag+時(shí)，菊粉

5、酶活明顯降低。蛋白抑制劑PMSF和碘乙酸能夠強(qiáng)烈抑制菊粉酶活力。純化后的菊粉酶對(duì)底物菊粉的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值和Vmax分別是21.1 mg/mL和0.082mg min-1蛋白，說(shuō)明其與底物親和力較高。純化菊粉酶對(duì)底物菊粉也具有很高的外切菊粉酶活力，水解底物層析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物只有單糖?？寺〉玫搅思疽裁僧叧嘟湍?P.guilliermondii)strain 1胞外菊粉酶基因INU的全長(zhǎng)(登陸號(hào)EUl95799)，共1542bp，無(wú)內(nèi)含子，根據(jù)D

6、NA序列推導(dǎo)出該了菊粉酶前體肽的氨基酸序列，共514個(gè)氨基酸，推導(dǎo)分子量為58042Da。利用生物學(xué)軟件分析菊粉酶基因INU及其上下游堿基序列，推導(dǎo)出其啟動(dòng)子和終止子位置及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等。分析菊粉酶前體肽氨基酸序列，推測(cè)出N端有18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，并含有10個(gè)可能的N端糖基化位點(diǎn)，對(duì)菊粉酶前體肽氨基酸序列的保守區(qū)進(jìn)行了分析，推測(cè)出約在20-300個(gè)氨基酸處具有糖苷酶家族N端特性。同時(shí)構(gòu)建pPICZaAINU表達(dá)載體，將克隆得到的str

7、ain 1菊粉酶基因INU在巴斯德畢赤酵母真核表達(dá)體系中進(jìn)行了功能表達(dá)。對(duì)重組酶進(jìn)行了進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和Western blotting分析，得到了大小為60kD的重組酶條帶，并通過(guò)免疫印跡證實(shí)了菊粉酶基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。誘導(dǎo)48h的重組菊粉酶粗酶液酶活為30.7±0.12U/ml，使用薄層層析方法檢測(cè)重組酶對(duì)底物菊粉的水解作用，證明了重組酶對(duì)菊粉有一定的水解作用。 同時(shí)還利用響表面方法(RSM)對(duì)海洋季也蒙畢

8、赤酵母strain 1的高產(chǎn)菊粉酶突變株M-30的固體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最終的最優(yōu)條件為初始濕度60.5％，接種量2.5％，麩皮：稻糠=0.42，30℃培養(yǎng)，初始pH6.5。在最優(yōu)條件下，突變株M-30固體發(fā)酵酶活達(dá)到455.9 U/gds，明顯高于原始菌株(291.0U/gdS)，說(shuō)明通過(guò)誘變方法確實(shí)使突變株的酶活力明顯得到了提高，具有穩(wěn)定的較高的外切菊粉酶活力。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于海洋季也蒙畢赤酵母(P.guill