海洋酵母普魯蘭類(lèi)酵母堿性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)、特性研究及基因克隆.pdf

1、本文主要討論了海洋酵母普魯蘭類(lèi)酵母A.pullulans 10堿性蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)及酶的分離純化、特性研究及基因克隆。 優(yōu)化了海洋酵母普魯蘭類(lèi)酵母A. pullulans 10固體發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶培養(yǎng)基主要成分和發(fā)酵條件。在豆餅粉和稻糠以4：1比例混合，含水量50％，添加含有2％硝酸鈉溶液酶活較高。最適固體發(fā)酵條件，接種量10<'7>cells/g培養(yǎng)基，裝量10 g/250ml三角瓶，溫度28℃，最適初始pH10.0。在優(yōu)化

2、的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，3天后酶活達(dá)到196.9U/g干培養(yǎng)基。 普魯蘭類(lèi)酵母10胞外蛋白酶通過(guò)分子篩Sephadex<'TM> G-75和陰離子交換柱DEAE Fast Flow分離純化，純化倍數(shù)和回收率分別為2.1和18.8％。純化酶SDS.PAGE凝膠電泳顯示分子量約為32kDa。純化酶的最適反應(yīng)pH 和最適反應(yīng)溫度分別為9.5和45℃，酶對(duì)溫度比較敏感，廣泛pH內(nèi)都有活性，確定普魯蘭類(lèi)酵母10胞外蛋白酶屬于堿性蛋白酶，命名

3、為ALPl。存在Mn<'2+>和低濃度Cu<'2+>(1 mM)時(shí)，蛋白酶酶活有一定程度的增加；當(dāng)存在Hg<'2+>、：Fe<'2+>、Fe<'2+>、Zn<'2+>、Co<'2+>、和高濃度的Cu<'2+>時(shí)，蛋白酶酶活明顯降低，純化酶活性被苯甲基磺酰氟(PMSF')強(qiáng)烈抑制，因此分離純化的堿性蛋白酶ALPl屬于絲氨酸蛋白酶。蛋白酶對(duì)底物酪蛋白的Km值和Vmax分別是0.25mg/ml和0.0286μmol/min/mg蛋白。

4、 用純化的堿性蛋白酶ALPl水解不同來(lái)源蛋白，能產(chǎn)生具有生物活性的多肽。水解海洋酵母蛋白、螺旋藻蛋白、蝦蛋白、牛奶蛋白和酪蛋白，所得到的水解產(chǎn)物都具有抑制ACE活性和抗氧化活性，但來(lái)自蝦蛋白的水解產(chǎn)物抑制ACE活性最高，達(dá)85.3％，來(lái)自螺旋藻蛋白的水解產(chǎn)物的抗氧化活性最高，達(dá)40.6％。沒(méi)有觀察到蛋白水解產(chǎn)物的抗菌活性。 簡(jiǎn)并引物法擴(kuò)增了編碼普魯蘭類(lèi)酵母10堿性蛋白酶ALPl的部分基因，片段長(zhǎng)度為576bp。反向PCR法擴(kuò)增得

5、到ALP1全長(zhǎng)及兩側(cè)部分基因序列，共2562bp。推導(dǎo)出了堿性蛋白酶基因ALP1 ORF框，共1349bp。RT-PCR得到堿性蛋白酶基因ALP1 cDNA，共1245bp，包括3個(gè)外顯子，分別為311bp、364bp、588bp。根據(jù)cDNA推導(dǎo)出普魯蘭類(lèi)酵母堿性蛋白酶ALP1前體肽的氨基酸序列，共415個(gè)氨基酸，分子量為42887Da。分析堿性蛋白酶基因ALP1及其上下游堿性序列，推導(dǎo)出其啟動(dòng)子位置、終止子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等。分析堿性蛋白酶