基因工程菊粉內(nèi)切酶畢赤酵母表達優(yōu)化與菊寡糖制備研究.pdf

1、菊糖是一種天然的果聚糖,是植物體內(nèi)的一種儲藏性碳水化合物.國內(nèi)外關于微生物菊粉內(nèi)切酶酶學性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、工程菌株構(gòu)建與生產(chǎn)應用方面的研究進展迅速,王建華小組已成功構(gòu)建兩株能高效表達菊粉內(nèi)切酶的基因工程酵母,該實驗利用其中一株基因工程酵母—畢赤嗜甲醇酵母(Pichia methanolica)進行高密度培養(yǎng)表達黑曲霉菊粉內(nèi)切酶,并對用于指導生產(chǎn)實踐的酶的一些特性進行了研究,利用菊苣為原料,采用現(xiàn)代生物技術和分析技術,對菊粉的提取和菊粉寡糖

2、的生產(chǎn)進行了較深入細致的研究,這對菊粉寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導意義.主要結(jié)果如下:1 菊粉內(nèi)切酶基因的表達 1.1 搖瓶培養(yǎng):通過不同碳源、不同誘導培養(yǎng)基、微量元素的濃度、菌體密度、pH值、甲醇濃度、甲醇誘導周期對酶蛋白表達的影響研究,對高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化.1.2 高密度培養(yǎng):采用三種培養(yǎng)基F<,1>、F<,2>、和F<,3>進行試驗,分別測定酵母的生長曲線,都符合指數(shù)生長曲線,細胞生長延遲期分別為1.36h,2.29h

3、,2.48h,比生長速率μ分別為0.4846h<'-1>,0.2856h<'-1>,0.2813h<'-1>.采用F<,1>培養(yǎng)基時,其優(yōu)點是不產(chǎn)生沉淀,酵母生長速度快,培養(yǎng)周期短.2 酶的特性研究表明,酶作用的最適溫度為55℃,高于60℃時開始失活;其最佳pH為5.5,在pH4.5到pH6.5時較為穩(wěn)定;Hg<'2+>、Pb<'2+>、Ba<'2+>對酶活具有顯著抑制作用;Ca<'2+>能顯著提高酶活,Mg<'2+>、Fe<'3+>、

4、Cu<'2+>、Zn<'2+>對酶活作用不明顯;EDTA對酶活具有部分抑制作用.酶底物研究表明,酶水解菊粉,但不水解棉子糖,水解蔗糖活性較低.3 在菊粉提取試驗中,采用干菊苣粉用循環(huán)方式進行水抽提,在料液比為1:15,溫度為80℃,浸提時間為2h時提取率達98﹪.4 在酶解試驗中,菊粉濃度為200g/L(即接觸最大溶解度)時,反應30h,菊粉寡糖最大產(chǎn)率為62.0﹪,菊粉寡糖的最大產(chǎn)率與酶的用量無關,但隨著酶濃度的提高,菊粉寡糖達到最大