菊粉內(nèi)切酶和蔗糖酶基因的高效重組表達及其在水解菊粉中的應用.pdf

1、菊粉酶(Inulinase)是一種呋喃果糖基水解酶,它靶向作用于菊粉中的β-2,1糖苷鍵并將其水解為果糖和葡萄糖。菊粉酶可以分為菊粉外切酶和菊粉內(nèi)切酶。菊粉外切酶可以從菊粉分子的非還原末端催化水解下β-D-呋喃果糖殘基,其底物可為菊粉、蔗糖和果聚糖;菊粉內(nèi)切酶可以水解菊粉內(nèi)部的β-2,1糖苷鍵使其變成菊糖三糖、菊糖四糖和菊糖五糖為主的菊粉寡糖。蔗糖酶(Invertase)是一種β-呋喃果糖苷酶,它可以催化蔗糖水解為果糖和葡萄糖,廣泛存在

2、于細菌、酵母、絲狀真菌、高等植物和許多動物細胞中。其中,酒精酵母的蔗糖酶已被深入研究,并廣泛應用于食品和發(fā)酵工業(yè)。酒精酵母的蔗糖酶主要是由SUC2基因編碼的。
　　本研究首先將節(jié)桿菌屬Arthrobacter sp. S37來源的菊粉內(nèi)切酶基因EnIA在酵母菌解脂亞羅維亞中表達,并研究了重組菊粉內(nèi)切酶的性質(zhì)及水解菊粉的產(chǎn)物。將菊粉內(nèi)切酶基因EnIA連接到表達質(zhì)粒pINA1317上,在Yarrowia lipolytica Po1h

3、中進行分泌表達。重組轉(zhuǎn)化子1317-EnIA生產(chǎn)的重組菊粉內(nèi)切酶的酶活力和比活力大小分別為16.7 U/mL和93.4 U/mg,表觀分子量大小為78.9 kDa。重組酶的最適pH值為4.0,在pH2.0-8.0范圍內(nèi),重組酶可以保持較高的活性。在40℃以下,重組酶有很好的穩(wěn)定性,其最適作用溫度為50℃。Li+離子對重組酶活性有激活作用。重組菊粉內(nèi)切酶水解菊粉的主要產(chǎn)物為菊粉二糖。當把重組菊粉內(nèi)切酶和菊粉外切酶混合水解菊粉時,混合物的菊

4、粉酶活力大于兩者菊粉酶相加之和,表現(xiàn)出協(xié)同作用。
　　本實驗室保藏的一株高產(chǎn)酒精酵母Saccharomyces sp. W0菌株可以緩慢地糖化菊粉產(chǎn)生單糖,利用菊粉發(fā)酵生產(chǎn)少量的酒精。將菊粉內(nèi)切酶基因EnIA在酒精酵母W0菌株中表達,提高W0菌株的菊粉酶活力和酒精產(chǎn)量。把菊粉內(nèi)切酶基因EnIA連接到酒精酵母表達載體pMIDSC31(δ序列插入型)和pMIRSC31(rDNA序列插入型)上,整合到W0菌株的基因組DNA中。δ序列插入

5、型重組轉(zhuǎn)化子D5的菊粉酶活力高于rDNA序列插入型重組轉(zhuǎn)化子R1。重組轉(zhuǎn)化子D5的菊粉酶活力達8.6 U/mL。在5-L發(fā)酵罐體系中,轉(zhuǎn)化子D5以菊粉含量為30％(w/v)的培養(yǎng)基進行酒精發(fā)酵,酒精產(chǎn)量為13.6%(v/v,20℃)。轉(zhuǎn)化子D5同步糖化生料菊芋粉,在1-L發(fā)酵體系中,酒精產(chǎn)量達10.1%(v/v,20℃)。
　　W0菌株具有很低的菊粉酶活性,根據(jù)氨基酸序列的多重比對分析結(jié)果推測可能與蔗糖酶基因SUC2相關(guān)。蔗糖酶基

6、因SUC2與酒精酵母具有菊粉酶活力可以發(fā)酵菊粉生產(chǎn)酒精之間的關(guān)系還鮮有報道。本研究將SUC2基因完全敲除并將原始SUC2基因在敲除菌株中超表達,根據(jù)敲除和超表達之后的實驗結(jié)果解釋蔗糖酶基因SUC2與W0菌株具有菊粉酶活性是否相關(guān)。蔗糖酶基因SUC2被敲除后,完全敲除菌株W4失去蔗糖酶和菊粉酶活力,不能在以蔗糖或菊粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常生長,可以在以果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。在敲除菌株W4中超表達蔗糖酶SUC2基因,超表達轉(zhuǎn)化子S

7、UC2-1的SUC2基因表達量為W0菌株的113.6倍,蔗糖酶和菊粉酶活力分別是W0菌株的2.53倍和6.60倍。SUC2基因超表達轉(zhuǎn)化子水解菊粉的產(chǎn)物是單糖,可以利用30%(w/v)的菊粉發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)13.4%(v/v,20℃)的酒精。在1-L發(fā)酵體系中,超表達轉(zhuǎn)化子SUC2-1同步糖化生料菊芋粉的酒精產(chǎn)量達10.9%(v/v,20℃)。本實驗首次證明W0菌株的SUC2基因與其胞外和胞內(nèi)菊粉酶活性有關(guān),也證明了在W0菌株中超表達蔗糖