決明子中主要有效成分hplc同時(shí)測(cè)定【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：決明子中主要有效成分HPLC同時(shí)測(cè)定</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) <

2、/p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信承諾書(shū)</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)），是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下嚴(yán)格按照學(xué)校和學(xué)院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人的觀點(diǎn)和參考資料

3、均加以注釋和說(shuō)明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）沒(méi)有抄襲他人研究（設(shè)計(jì)）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）若有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。</p><p>　　學(xué)生簽名： __________</p><p>　　日 期： __________&l

4、t;/p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　目的：建立決明子蒽醌類成分的含量測(cè)定法及HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定決明子中橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量。方法：總蒽醌聚酰胺吸附純化樣品，紫外分光光度直接測(cè)定，各組分蒽醌HPLC梯度洗脫法。色譜柱：依力特YWG C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸

5、溶液；梯度洗脫：0~15min（45~58：55~42），15~22min（58~65：42~35），22~30min（65~78：35~22），30~35min（78：22），35~40min（78~90：22~10）；流速1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm。結(jié)果：在5~20μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)照品1，8-二羥基蒽醌的吸收度與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9986。決明子最大吸收波長(zhǎng)為429.0nm，線性關(guān)系曲線方程為：，平均

6、回收率為99.56%，RSD=0.45%（n=9）。橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的線性方程分別為y=5520.1x+21.393，r=0.9999；y=2717.4x+2.1785，r=0.9995；y=1598.3x+4.4959，r=0.9989；y</p><p>　　關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；紫外分光光度法；決明子；蒽醌</p><p><b>　　ABSTRAC

7、T</b></p><p>　　Qbjective:This study aimed to establish the content determination of anthr-aquinones in Semen Cassiae and the content of aurantio-obtusin,emodin,chrysop-hanol,physeione in semen cassiae

8、by HPLC.Methods:Polyamide adsorption purif-ication of anthraquiniones,Ultraviolet spectrophotometric direct determination.Co-mponents anthraquinone HPLC gradient elution method.A C18 column(250mm×4.6mm，5μm)was used

9、for the gradient with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution:0~15min(45~58:55~42),15~22min(58~</p><p>　　y=1598.3x+4.4959,r=0.9989;y=2444.1x-8.9815,r=0.9948,the average recovery rate:97.3%(RSD=1.34%),102

10、.7%(RSD=2.87%),104.4%(RSD=4.19%),101.0%(RSD=5.72%).Conclusion:Ultraviolet spectrophotometry-polyamide purifying method for rap-id,sensitive,reproducible,accurate determination of anthraquinones contents in ca-ssiae.HPLC

11、gradient elution method has high specificity,good reproducibility,canbe used in aurantio-obtusin,emodin,chrysophanol,physeione content determination.</p><p>　　Key words: HPLC; UV spectrophotometry; cassia; A

12、nthraquinone</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 決明子應(yīng)用的研究現(xiàn)狀1</p><p>　　1.2 本課題的研究目的和意義2</p><p><b>　　2 材

13、料與方法2</b></p><p>　　2.1 藥品與材料2</p><p>　　2.2 試劑配制與材料預(yù)處理3</p><p>　　2.3 儀器設(shè)備3</p><p>　　2.4 總蒽醌的聚酰胺微柱-紫外分光光度測(cè)定4</p><p>　　2.4.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定4</p>

14、<p>　　2.4.2 聚酰胺微柱的制備4</p><p>　　2.4.3 樣品過(guò)聚酰胺的光譜圖測(cè)定4</p><p>　　2.4.4 聚酰胺微柱對(duì)1，8-二羥基蒽醌的測(cè)定條件實(shí)驗(yàn)4</p><p>　　2.4.5 總蒽醌測(cè)定線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)5</p><p>　　2.4.6 總蒽醌測(cè)定的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)5</p>

15、<p>　　2.4.7 決明子總蒽醌含量測(cè)定5</p><p>　　2.5 決明子中主要四種蒽醌含量的HPLC梯度洗脫測(cè)定法6</p><p>　　2.5.1 HPLC梯度洗脫色譜條件方法建立6</p><p>　　2.5.2 四種蒽醌線性關(guān)系測(cè)定方法6</p><p>　　2.5.3 四種蒽醌的HPLC測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證6&

16、lt;/p><p>　　2.5.4 決明子樣品中四種蒽醌的含量測(cè)定7</p><p>　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論7</p><p>　　3.1 決明子中總蒽醌聚酰胺微柱-分光光度法測(cè)定結(jié)果7</p><p>　　3.1.1 1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品的光譜圖7 </p><p>　　3.1.2 1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品過(guò)聚

17、酰胺微柱圖譜7</p><p>　　3.1.3 樣品過(guò)聚酰胺微柱的條件確定結(jié)果8</p><p>　　3.1.4 線性關(guān)系9</p><p>　　3.1.5 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果10</p><p>　　3.1.6 決明子中總蒽醌的含量測(cè)定結(jié)果11</p><p>　　3.2 決明子中四種主要蒽醌的HPLC同時(shí)測(cè)定

18、結(jié)果12</p><p>　　3.2.1 決明子中蒽醌同時(shí)測(cè)定的色譜條件12</p><p>　　3.2.2 四種蒽醌的線性方程14</p><p>　　3.2.3 四種蒽醌的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果16</p><p>　　3.2.4 不同產(chǎn)地樣品中四種蒽醌測(cè)定結(jié)果19</p><p><b>　　4 結(jié)論

19、20</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)22</b></p><p><b>　　致 謝24</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　1.1 決明子應(yīng)用的研究現(xiàn)狀</p><p>　　決明子

20、為豆科植物決明子Cassia tora L及鈍葉決明Cassia Obusifolia L的干燥成熟種子，味甘、苦、咸，性微寒。最早《神農(nóng)本草經(jīng)》中將決明子列為上品，稱之“能治諸眼疾，久服益精光，輕身?！薄度悍阶V》亦載：“決明子可做茶食，治目中諸疾，助肝益精?！盵1]現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，決明子具有降壓、調(diào)脂、保肝和改善腎功能等功效，是中藥治療心腦血管疾病、高脂血癥、便秘的代表性藥物。決明子是一種食、藥兩用的中藥材，民間常用決明子泡茶飲，或與其

21、他藥物配伍。</p><p>　　陳曉琳[2]研究認(rèn)為決明子“歸肝經(jīng)”能保護(hù)肝臟，明目，降壓。決明子歸肝經(jīng)，目為肝竅，為明目之佳品，臨床上廣泛用于眼科，主治急性外眼炎癥[3]。決明子的生、炒兩類炮制品均可用于保肝降酶活性，生、炒決明子及其不同提取部位，能明顯降低背部皮下注射四氯化碳急性肝損傷模型小鼠的血清AST、ALT含量[4]，升高SOD活性，降低MDA含量[5]，固可用于治療酒精肝。決明子“歸大腸經(jīng)”具有潤(rùn)腸

22、通便之功效。決明子入大腸經(jīng)，苦，微寒，具有潤(rùn)腸通便之功效?，F(xiàn)代研究認(rèn)為決明子中大黃酚二蒽酮苷等結(jié)合型蒽醌促使腸壁減少了固醇類食物的吸收，從而增強(qiáng)了腸道的排泄功能。決明子產(chǎn)品以平肝潛陽(yáng)、清濕熱、祛痰濁，潤(rùn)腸通便為理論基礎(chǔ)，進(jìn)而達(dá)到降脂作用?，F(xiàn)代藥理研究，決明子含蒽醌類衍生物，有降低血清總膽固醇和甘油三酯的作用[6]。</p><p>　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，決明子水提醇沉物靜脈注射，可使自發(fā)性遺傳性高血壓大鼠收縮壓、舒張壓

23、顯著降低，且降壓幅度和持續(xù)時(shí)間顯著優(yōu)于利血平[7]。劉先寧等[8]證實(shí)了決明子對(duì)體內(nèi)外細(xì)胞免疫功能有抑制作用，對(duì)體液免疫功能無(wú)明顯影響，并且對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能有增強(qiáng)作用，與殼聚糖聯(lián)用可提高機(jī)體的非特異性免疫功能。另外，臨床用藥表明，決明子還能治療乳腺小葉增生、男性慢性乙型肝炎乳房發(fā)育癥等癥。</p><p>　　方雪琴[9]研究SD大鼠實(shí)驗(yàn)證明，不同組的大鼠分別服含不同濃度（1％、2％、4％、8％、16％和32％

24、）決明子的營(yíng)養(yǎng)飼料。第8天，服含32％決明子飼料組的大鼠全部死亡。隨著決明子在飼料中所占比例增加，動(dòng)物體重與食物及水的消耗成相關(guān)性降低。當(dāng)飼料中決明子的比例大于8％后，對(duì)大鼠睪丸和骨髓有一定的毒性，引起精子數(shù)明顯減少，骨髓減輕、骨髓中多色紅細(xì)胞數(shù)減少。已有實(shí)驗(yàn)證明，藥用植物中的蒽醌類化合物具有致癌作用。</p><p>　　1.2 本課題的研究目的和意義</p><p>　　決明子的降壓、

25、調(diào)脂、保肝等功能使其具有減肥效用[10]。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)決明子藥材減肥效用的研究日趨增多，有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。現(xiàn)今，決明子紫外分光光度法測(cè)定總蒽醌大多采用醋酸鎂顯色法[1]，但實(shí)驗(yàn)證明，該方法干擾性較多，測(cè)定誤差較大。故本文采用聚酰胺分離純化-紫外分光光度直接測(cè)定方法對(duì)總蒽醌進(jìn)行測(cè)定。中國(guó)藥典2005版[11]以大黃酚作為主要成分含量測(cè)定指標(biāo)，而大黃酚為大黃、何首烏、虎杖、蘆薈等藥材的共有活性成分，非決明子的專屬性成分，其含量只能在一

26、定程度上反映決明子的質(zhì)量。中國(guó)藥典2010版[12]在此基礎(chǔ)上則增加了橙黃決明素作為指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制。大黃素、大黃素甲醚具有抗菌、用于瀉藥、治療腫癌等常用作用，臨床應(yīng)用極廣，在各種中草藥內(nèi)廣泛存在。故本文采用HPLC梯度洗脫法測(cè)定決明子中主要四種蒽醌橙黃決明素、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚的含量，為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與資源開(kāi)發(fā)提供方法參考。</p><p><b>　　2 材料與方法</b>

27、;</p><p><b>　　2.1 藥品與材料</b></p><p>　　1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20090324）；大黃素（西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：XC110721，純度：98%），大黃素甲醚（西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：XC110811，純度：98%），大黃酚（上海源葉生物科技有限公司，YY90046，

28、純度：98%），橙黃決明素（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-10111501，純度：98%），供HPLC含量測(cè)定用。</p><p>　　10批決明子藥材均在寧波和紹興的藥店購(gòu)置，藥材原產(chǎn)地為：遼寧、山西、溫州、江蘇、杭州、越南、山東、廣西玉林、福建、紹興。另紫外分光光度-聚酰胺微柱法使用決明子藥材為：河北（批號(hào)：1310040202）。經(jīng)鑒定均符合2010版《中國(guó)藥典》一部決明子項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。<

29、;/p><p>　　乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。甲醇、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、石油醚等實(shí)驗(yàn)用的其他試劑均為分析純。</p><p>　　聚酰胺（上海摩速科學(xué)器材有限公司，100-200目樹(shù)脂，批號(hào)：20110515）；微孔濾膜（偏氟膜，上海市亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司，孔徑：0.25μm）。色譜柱：依力特YWG C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。2.5mL微型注射器數(shù)只。</p

30、><p>　　2.2 試劑配制與材料預(yù)處理</p><p>　　決明子脫脂：取適量決明子于80℃烘干1h后研磨，過(guò)16目篩，加適量石油醚于回流瓶中脫脂（80℃，1h），烘干備用。</p><p>　　聚酰胺預(yù)處理：使用前用95%乙醇浸泡過(guò)夜，次日用蒸餾水洗至無(wú)乙醇，80℃下烘干，裝袋備用。</p><p>　　10%鹽酸配制：精密量取10mL濃鹽

31、酸于100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度后備用。</p><p>　　0.1%磷酸-水溶液配制：精密吸量0.1mL磷酸于100mL量瓶中，用純化水（色譜用）定容至刻度，過(guò)濾3次，超聲波15min脫氣后備用（臨用現(xiàn)配），pH約為2。</p><p>　　1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品溶液配制：準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的1，8-二羥基蒽醌10.71mg，置于50mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解定容至刻度，得含

32、量為0.2142mg/mL的1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品貯備液。</p><p>　　橙黃決明素對(duì)照品溶液配制：精密稱取橙黃決明素對(duì)照品（純度為98%）10mg于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得0.196mg/mL橙黃決明素對(duì)照品溶液。</p><p>　　大黃素對(duì)照品溶液0.198mg/mL，大黃酚對(duì)照品溶液0.229mg/mL，大黃素甲醚對(duì)照品溶液0.196mg/mL，均按橙黃決明素

33、對(duì)照品溶液配制方法制備。</p><p>　　供試品溶液制備[12]：精密稱取處理過(guò)的決明子粉末0.5g，放置于錐形瓶中，加入乙醇50mL，稱定重量，置水?。?0~90℃）上加熱回流2h，放冷，搖勻，過(guò)濾。取續(xù)濾液10mL加10mL鹽酸溶液置水浴中加熱水解1h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖萃取多次至溶液接近無(wú)色。將萃取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，回收三氯甲烷后并加無(wú)水乙醇溶解，定容至10mL容量瓶中，備用。（HPLC方法中

34、，乙醇改為甲醇）。</p><p><b>　　2.3 儀器設(shè)備</b></p><p>　　本研究所采用的主要儀器和設(shè)備（見(jiàn)表 1）。</p><p>　　表1 主要儀器和設(shè)備 </p><p>　　2.4 總蒽醌的聚酰胺微柱-紫外分光光度測(cè)定</p><p>　　2.4.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)

35、定</p><p>　　吸取1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品溶液適量，于10mL量瓶中，定容至刻度，以無(wú)水乙醇做空白，在200~600nm范圍內(nèi)于UV分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描[14]。</p><p>　　2.4.2 聚酰胺微柱的制備</p><p>　　稱取適量聚酰胺(已處理)于2.5mL微柱中，裝柱時(shí)要注意聚酰胺柱不要填充過(guò)緊密，以便后續(xù)樣品能均勻地被聚酰胺吸附。加樣時(shí)樣

36、品盡量滴加在聚酰胺上，勿滴加于容器壁上，洗脫之前用真空抽至緊密，并促使溶劑揮發(fā)。</p><p>　　2.4.3 樣品過(guò)聚酰胺的光譜圖測(cè)定</p><p>　　精密量取1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品0.5mL滴加于2.5mL微柱中，平衡一段時(shí)間后揮干溶劑。滴加適量乙醇洗脫，洗脫液于300~600nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。</p><p>　　2.4.4 聚酰胺微柱對(duì)1，8-

37、二羥基蒽醌的測(cè)定條件實(shí)驗(yàn)</p><p><b>　?、傧疵搫┐_定</b></p><p>　　取供樣品、對(duì)照品0.5mL滴加于微柱中，平衡一段時(shí)間后揮干溶劑。分別加入一定體積蒸餾水、20%乙醇、70%乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液于200~600nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，并于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[15]。</p><p>　　②樣品平衡吸附時(shí)

38、間考察</p><p>　　在不同的吸附平衡時(shí)間5min、10min、30min、60min、90min、120min，加入10mL水洗脫，洗脫后測(cè)定吸光度。</p><p><b>　?、巯疵搫┯昧靠疾?lt;/b></p><p>　　以2BV/h的流速滴加濃度為70%的乙醇溶液10mL進(jìn)行洗脫，每2mL收集一次洗脫液，分別測(cè)定吸光度值，洗脫至吸

39、光度測(cè)定趨于0。</p><p>　　2.4.5 總蒽醌測(cè)定線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)</p><p>　　精密吸取上述配制的1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL至10mL量瓶中，用乙醇定容至刻度。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，以A對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。</p><p>　　2.4.6 總蒽醌測(cè)定的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)</p>

40、<p>　　2.4.6.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)</p><p>　　將對(duì)照品溶液及供試品溶液在室溫下避光放置一段時(shí)間，分別在0h、1h、2h、3h、4h、5h內(nèi)測(cè)定其吸光度值。</p><p>　　2.4.6.2 精密度試驗(yàn)</p><p>　　連續(xù)測(cè)定一份過(guò)聚酰胺樹(shù)脂的供試品溶液吸光度5次，記錄吸光度值。</p><p>　　2.4.6.

41、3 回收率試驗(yàn)</p><p>　　精密吸取供試品溶液4mL，對(duì)照品溶液1mL于10mL容量瓶中，混合后揮干溶劑，乙醇定容，混勻備用。即得到供試品溶液與對(duì)照品溶液4:1混合液。供試品溶液與對(duì)照品溶液3:2,2:3混合液按上述方法同樣制備。</p><p>　　制9支聚酰胺柱，分別標(biāo)記為低中高各三份，記為1~9號(hào)，對(duì)照為ST1~3。在1、2、3中按4：1配制的溶液加入0.5mL；4、5、6中

42、加入按3：2配制的溶液0.5mL；7、8、9中加入按2：3配制的溶液0.5mL；ST1~3中加入0.5mL供試品溶液。平衡1.5h后，分別用10mL蒸餾水水洗脫，10mL 20%乙醇洗脫，10mL 70%乙醇洗脫。分別收集70%的洗脫液，測(cè)定其吸光度。</p><p>　　2.4.7 決明子總蒽醌含量測(cè)定</p><p>　　取上述決明子供試品溶液0.5mL，按上述方法過(guò)聚酰胺微柱，收集7

43、0%洗脫液在200~600nm范圍內(nèi)冊(cè)測(cè)定吸收光譜圖。在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，平行3份，計(jì)算總蒽醌含量。</p><p>　　決明子總蒽醌的含量及總蒽醌的提取率按下式計(jì)算：</p><p>　　2.5 決明子中主要四種蒽醌含量的HPLC梯度洗脫測(cè)定法</p><p>　　2.5.1 HPLC梯度洗脫色譜條件方法建立</p><p>　

44、　參考文獻(xiàn)資料[16-21]，HPLC梯度洗脫法測(cè)定各組分蒽醌含量的方法有多種。其中大多以甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈和0.1%磷酸水溶液為主。本文采用以乙腈和0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，對(duì)梯度洗脫條件進(jìn)行考察優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)柱溫：室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm，流速：lmL/min。</p><p>　　2.5.2 四種蒽醌線性關(guān)系測(cè)定方法</p><p>　　精密量取橙黃決明素對(duì)照品溶液1

45、mL、大黃素對(duì)照品溶液1mL、大黃酚對(duì)照品溶液2mL、大黃素甲醚對(duì)照品溶液1mL于10mL量瓶中，甲醇定容，混勻，過(guò)濾即得混合對(duì)照品溶液。其中橙黃決明素濃度為19.6μg/mL，大黃素濃度為19.8μg/mL，大黃酚濃度為45.8μg/mL，大黃素甲醚濃度為19.6μg/mL的混合對(duì)照品溶液配制。</p><p>　　取上述混合對(duì)照品，進(jìn)樣1μL、2μL、4μL、8μL、10μL，測(cè)定各組分峰面積積分值，以進(jìn)樣量

46、（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。</p><p>　　2.5.3 四種蒽醌的HPLC測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證</p><p>　　2.5.3.1 精密度試驗(yàn)</p><p>　　精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積積分值，計(jì)算RSD值。</p>&

47、lt;p>　　2.5.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)</p><p>　　取一批樣品粉末，平行稱量5份，按供試品制備方法制備，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定其峰面積積分值，計(jì)算RSD值。</p><p>　　2.5.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)</p><p>　　取一批樣品粉末，按供試品制備方法制備，在室溫下避光放置一段時(shí)間，分別于1h、2h、4h、8h、24h內(nèi)進(jìn)樣10μL，測(cè)定其峰面

48、積積分值，計(jì)算RSD值。</p><p>　　2.5.3.4 加樣回收率試驗(yàn)</p><p>　　精密量取橙黃決明素對(duì)照品溶液2mL、大黃素對(duì)照品溶液1mL、大黃酚對(duì)照品溶液2mL、大黃素甲醚對(duì)照品溶液1mL于10mL量瓶中，甲醇定容，混勻，過(guò)濾即得混合對(duì)照品溶液。其中橙黃決明素濃度為39.2μg/mL，大黃素濃度為19.8μg/mL，大黃酚濃度為45.8μg/mL，大黃素甲醚濃度為19.

49、6μg/mL的混合對(duì)照品溶液。</p><p>　　按下表精密配制供試品（廣西玉林）及混合對(duì)照品混合溶液，分別平行3份，定容于10mL容量瓶中，測(cè)定加樣回收率。</p><p>　　表2 加樣回收率三水平試驗(yàn)配比</p><p>　　2.5.4 決明子樣品中四種蒽醌的含量測(cè)定</p><p>　　分別取全國(guó)不同產(chǎn)地的決明子藥材粉末0.5g（

50、已脫脂），精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，分別吸取各供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。2010版中國(guó)藥典[12]規(guī)定，決明子藥材大黃酚含量不得少于0.20%，橙黃決明素含量不得低于0.08%。</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 決明子中總蒽醌聚酰胺微柱-分光光度法測(cè)定結(jié)果</p><p&

51、gt;　　3.1.1 1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品的光譜圖</p><p>　　由2.4.1可得決明子總蒽醌在200~600nm下掃描圖譜如下：</p><p>　　圖1 1，8-二羥基蒽醌最大吸收波長(zhǎng)圖譜 </p><p>　　結(jié)果顯示1，8-二羥基蒽醌在429.0nm處有最大吸收波長(zhǎng)。</p><p>　　3.1.2 1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品

52、過(guò)聚酰胺微柱圖譜</p><p>　　由3.1.3方法可得到的圖譜如下：</p><p>　　圖2 1，8-二羥基蒽醌過(guò)聚酰胺最大吸收波長(zhǎng)圖譜 圖3 決明子總蒽醌過(guò)聚酰胺柱圖譜</p><p>　　由圖1圖2可知1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品過(guò)聚酰胺微柱與未過(guò)微柱最大吸收波長(zhǎng)不變，仍為429nm，圖3決明子蒽醌供試品過(guò)柱最大吸收波長(zhǎng)與1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品一致。<

53、/p><p>　　3.1.3 樣品過(guò)聚酰胺微柱的條件確定結(jié)果</p><p>　　3.1.3.1 洗脫劑確定結(jié)果</p><p>　　用一定體積的蒸餾水、20%乙醇洗脫，測(cè)定吸光度，得如下圖譜：</p><p>　　圖3 蒸餾水、20%乙醇洗脫吸光度圖譜(300~600nm)</p><p>　?。ㄉ?20%乙醇洗脫光譜圖

54、 中:蒸餾水洗脫光譜圖 下:基線）</p><p>　　由此圖譜可知，20%和水洗基本上洗脫不出對(duì)照品，故可用于洗脫決明子蒽醌提取物中的雜質(zhì)。</p><p>　　3.1.3.2 樣品平衡吸附時(shí)間考察結(jié)果</p><p>　　由2.4.4中方法可得如下表結(jié)果：</p><p>　　表3 平衡吸附時(shí)間考察結(jié)果</p><

55、;p>　　由表可知，聚酰胺平衡時(shí)間到達(dá)90min時(shí)，用70%的乙醇洗脫對(duì)照品可洗脫完全。故可確定洗脫時(shí)間為90min。</p><p>　　3.1.3.3 洗脫劑用量考察結(jié)果</p><p>　　由2.4.4中方法可得到如下表格：</p><p>　　表4 洗脫劑體積考察表</p><p>　　由表格可知，洗脫液體積約11mL左右即可

56、洗脫下回收率為99.4%的對(duì)照品。故實(shí)驗(yàn)使用洗脫液體積為10mL。</p><p>　　3.1.4 線性關(guān)系</p><p>　　由2.4.5方法可得到如下圖表：</p><p>　　表5 1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表</p><p>　　圖4 1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜</p><p>　　由上述圖表可得回

57、歸方程：。結(jié)果表明，1，8-二羥基蒽醌濃度在5~20μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。</p><p>　　3.1.5 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果</p><p>　　3.1.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　由2.4.6.1方法測(cè)定，5小時(shí)內(nèi)蒽醌吸光度穩(wěn)定，平均值為0.554，RSD=0.44%，故該方法穩(wěn)定性良好。</p><p>　　3.1.5.

58、2 精密度試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　由2.4.6.2方法測(cè)定，五次吸光度均為0.554。故該方法精密度良好。</p><p>　　3.1.5.3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　由3.1.6.3實(shí)驗(yàn)可得到結(jié)果如下：</p><p><b>　　標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：</b></p><p>　

59、　由測(cè)定的吸光度A(即y值)可求的x，即濃度C值。</p><p>　　取上述對(duì)照品1mL、2mL、3mL配置的混合溶液中溶度分別為：21.42μg/mL、42.84μg/mL、64.26μg/mL。</p><p>　　表6 1，8-二羥基蒽醌加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）</p><p>　　3.1.6 決明子中總蒽醌的含量測(cè)定結(jié)果</p><

60、;p>　　由1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)曲線公式可求得總蒽醌含量，如下：</p><p>　　表7 決明子總蒽醌含量測(cè)定表</p><p>　　由上得該批決明子藥材樣品中總蒽醌含量為0.2%，RSD為0.78%。</p><p>　　3.2 決明子中四種主要蒽醌的HPLC同時(shí)測(cè)定結(jié)果</p><p>　　3.2.1 決明子中蒽醌同時(shí)測(cè)定的色

61、譜條件</p><p>　　由2.5.1方法可得如下表所得的梯度洗脫條件。</p><p>　　表8 HPLC梯度洗脫條件</p><p>　　得到對(duì)照品與決明子供試品（溫州）圖譜如下：</p><p>　　圖5 混合對(duì)照品HPLC色譜圖及決明子藥材供試品色譜圖</p><p>　?。ㄗ? 1.橙黃決明素2.大黃素3

62、.大黃酚4.大黃素甲醚）</p><p>　　在該試驗(yàn)條件下，供試品中各組分蒽醌分離度良好，其中理論塔板數(shù)（n>3000）、分離度（R>1.5）、拖尾因子、保留時(shí)間等因素均符合藥典要求。結(jié)果見(jiàn)表9。</p><p>　　表9 各組分蒽醌HPLC分離因素表</p><p>　　3.2.2 四種蒽醌的線性方程</p><p>　　3.

63、2.2.1 橙黃決明素線性關(guān)系</p><p>　　由2.5.2中方法可得到如下結(jié)果：</p><p>　　表10 橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)值</p><p>　　圖6 橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　結(jié)果表明：橙黃決明素在0.196~0.0196μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為。</p><p>　　3.

64、2.2.2 大黃素線性關(guān)系</p><p>　　由2.5.2中方法可得到如下結(jié)果：</p><p>　　表11 大黃素線性關(guān)系相關(guān)數(shù)值</p><p>　　圖7 大黃素線性關(guān)系圖譜</p><p>　　結(jié)果表明：大黃素在0.020~0.198μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程是。</p><p>　　3.2.2.3 大

65、黃酚線性關(guān)系</p><p>　　由2.5.2中方法可得到如下結(jié)果：</p><p>　　表12 大黃酚線性關(guān)系相關(guān)數(shù)值</p><p>　　圖8 大黃酚線性關(guān)系圖譜</p><p>　　結(jié)果表明：大黃酚在0.046~0.458μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程是。</p><p>　　3.2.2.4 大黃素甲醚線性關(guān)

66、系</p><p>　　由2.5.2中方法可得到如下結(jié)果：</p><p>　　表13 大黃素甲醚線性關(guān)系相關(guān)數(shù)值</p><p>　　圖9 大黃素甲醚線性關(guān)系圖譜</p><p>　　大黃素甲醚在0.0196~0.196μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程是。</p><p>　　3.2.3 四種蒽醌的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果&

67、lt;/p><p>　　3.2.3.1 精密度試驗(yàn)</p><p>　　由2.5.3.1可得精密度試驗(yàn)結(jié)果如下表：</p><p>　　表14 四種蒽醌精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）mAU*s</p><p>　　由上表可知四種蒽醌精密度良好。</p><p>　　3.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)</p><p&

68、gt;　　取決明子粉末按2.5.3.2方法，可得四種蒽醌重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表15。</p><p>　　表15 四種蒽醌重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）mAU*s</p><p>　　3.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)</p><p>　　由2.5.3.3方法可得供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表16。</p><p>　　表16 四種蒽醌穩(wěn)定性試驗(yàn)

69、結(jié)果（n=5）mAU*s</p><p>　　3.2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)</p><p>　　按上述含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，得到峰面積值表如下：</p><p>　　表17 決明子四種主要蒽醌峰面積值表mAU*s</p><p><b>　　由回收率公式：；</b></p><p>　　

70、橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=5520.1x+21.393，r=0.9999；</p><p>　　大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：；</p><p>　　大黃酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：；</p><p>　　大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：；</p><p>　　四種蒽醌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可求得濃度C；；</p><p>　　即可求得10μL里、、；&l

71、t;/p><p><b>　　加樣回收率：。</b></p><p>　　表18 決明子蒽醌加樣回收率表（n=9）</p><p>　　由上表可得到橙黃決明素的平均加樣回收率分別為97.3%，RSD為1.34%；大黃素平均加樣回收率別為102.7%，RSD為2.87%；大黃酚平均加樣回收率分別為104.4%，RSD為4.19%；大黃素甲醚平均加樣

72、回收率分別為101.0%，RSD為5.72%。</p><p>　　3.2.4 不同產(chǎn)地樣品中四種蒽醌測(cè)定結(jié)果</p><p>　　按上述2.5.4的方法，可得各產(chǎn)地決明子峰面積值如下表：</p><p>　　表19 各地區(qū)市售決明子藥材HPLC峰面積值表mAU*s</p><p>　　由橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=5520.1x+21.3

73、93，r=0.9999；</p><p>　　大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：；</p><p>　　大黃酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：；</p><p>　　大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：</p><p>　　以產(chǎn)地為溫州的決明子為例：橙黃決明素峰面積值為714.61。</p><p>　　其他各組分蒽醌含量同上述方法計(jì)算，得到結(jié)果如下：</

74、p><p>　　表20 各地區(qū)市售決明子藥材含量測(cè)定（n=3）%</p><p>　　由表可知全國(guó)10個(gè)產(chǎn)地決明藥材中的橙黃決明素含量在0.0580%~0.1457%之間；大黃素含量在0.0084%~0.1977%之間；大黃酚含量在0.1244%~0.4023%之間；大黃素甲醚含量在0.0536%~0.1340%之間；4種蒽醌類成分總含量在0.3178%~0.6889%之間。結(jié)果顯示，4種蒽

75、醌類成分中大黃酚、橙黃決明素含量普遍較高，大黃素、大黃素甲醚含量均較低。對(duì)比大黃素甲醚及大黃素含量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，大黃素甲醚含量較高大黃素含量則較低，大黃素含量較高則大黃素甲醚含量較低，故決明子中該兩種蒽醌呈對(duì)應(yīng)關(guān)系存在。大黃酚等4種成分的含量以江蘇、杭州和紹興含量較高，而山西和山東較低。決明子產(chǎn)地不同，其大黃酚等四種蒽醌含量均有一定變化。其中有3個(gè)產(chǎn)地的藥材大黃酚含量，2個(gè)產(chǎn)地決明子藥材橙黃決明素含量低于2010版《中國(guó)藥典》的規(guī)定。<

76、;/p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　受醌式結(jié)構(gòu)影響，決明子蒽醌于可見(jiàn)光區(qū)428nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收峰，因此無(wú)需復(fù)雜的顯色處理過(guò)程。本文增加了聚酰胺樹(shù)脂純化決明子藥材，去除了決明子藥材中一部分非蒽醌類物質(zhì)，使樣品與對(duì)照品溶液的掃描圖最大吸收波長(zhǎng)一致，從而更準(zhǔn)確地反應(yīng)決明子藥材中蒽醌類成分的含量。從線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性及加樣回收率等實(shí)驗(yàn)結(jié)

77、果看出用紫外分光光度法測(cè)定決明子中總蒽醌類成分的含量準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，方法簡(jiǎn)便易操作。</p><p>　　本文在2010藥典方法上增加了大黃素甲醚、大黃素的含量測(cè)定采用HPLC測(cè)定方法，采用梯度洗脫的方法，使溶劑強(qiáng)度在色譜過(guò)程中逐漸增加，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為洗脫劑，在278nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，四種蒽醌與其他蒽醌達(dá)到基線分離，在40min內(nèi)洗脫完全。得到橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的線性關(guān)系良好，

78、得到峰型分離度良好，出峰時(shí)間較快，峰形尖銳、對(duì)稱。故該方法可為藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與資源開(kāi)發(fā)提供方法參考。對(duì)全國(guó)10個(gè)不同產(chǎn)地樣品含量測(cè)定，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地決明子四種蒽醌的含量有較大差異，可達(dá)50%以上甚至更大。</p><p>　　本文建議，可在決明子總蒽醌提取聚酰胺純化的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)展總蒽醌提取工藝設(shè)計(jì)及優(yōu)化，并可結(jié)合決明子有效成分提取動(dòng)力學(xué)研究、熱力學(xué)研究，為提取速率、提取率等提供參考。</p>

79、<p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 劉偉民.決明子配方顆粒制備及提取過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué)2010屆博士學(xué)位論文,2010.4:23-26.</p><p>　　[2] 陳曉琳.決明子性味歸經(jīng)與現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7(6):159-160.</p><p>　

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87、高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地決明子中橙黃決明素含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2006,17(7):1138-1139.</p><p>　　[22] 任愛(ài)紅,胡詠梅,閆君寶,等.決明子對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,16(6):1490-1492.</p><p>　　[23] Zhihong Shi,Huixian Jiang,Junjing et al.Determ

88、ination of Anthraquinone Derivatives in Chang-Qing Tea by Using Cloud-point Extraction and High-Performance Liquid Chromatography[J].Food Ecol,Methods,2008,42(20):95-101.</p><p><b>　　致 謝</b><

89、/p><p>　　本論文是在劉老師的悉心指導(dǎo)下完成的，從論文的選題、實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)到論文的完稿，劉老師均給予了無(wú)私的指導(dǎo)，劉老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲凶黠L(fēng)、敏銳的科研思想、不斷創(chuàng)新的科研精神和平感近人的態(tài)度都令我深深佩服，在此向她表示崇高的敬意和感謝。</p><p>　　實(shí)臉自始至終都得到劉老師的悉心指導(dǎo)，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和具體實(shí)驗(yàn)操作到實(shí)驗(yàn)器材的提供等各個(gè)方面都給予了精心的指導(dǎo)和幫助，審查論文時(shí)字字推敲、句句斟

90、酌，深刻地指出了論文中一些不完善的地方，并以她的博學(xué)開(kāi)拓了我的視野，讓我修正了論文，順利完成了論文的寫(xiě)作。</p><p>　　老師豐富的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲凶黠L(fēng)，獻(xiàn)身科研的敬業(yè)精種都使我深受感動(dòng)，在此向他們致以由衷的敬意與感謝。</p><p>　　感謝實(shí)驗(yàn)室的每位成員，他們既是我的同窗，更是我的益友，無(wú)論在工作上還是生活上都給予了我極大的關(guān)心和幫助。在此，一并表示衷心的感謝！</p&