應(yīng)用電子鼻對(duì)幾種腐敗菌的鑒別研究【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　應(yīng)用電子鼻對(duì)幾種腐敗菌的鑒別研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 食品質(zhì)量與

2、安全 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b><

3、/p><p><b>　　0 引言1</b></p><p><b>　　1 材料和方法2</b></p><p>　　1.1 原料和試劑2</p><p>　　1.2 儀器和設(shè)備2</p><p><b>　　2 方法3</b></p>

4、;<p>　　2.1 培養(yǎng)基的制備3</p><p>　　2.1.1 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基制備3</p><p>　　2.1.2 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制備3</p><p>　　2.1.3 滅菌過(guò)程3</p><p>　　2.1.4 倒平板3</p><p>　　2.2 菌種的準(zhǔn)備3<

5、;/p><p>　　2.2.1 菌種活化3</p><p>　　2.2.2 涂布3</p><p>　　2.2.3 液體接種3</p><p>　　2.2.4 平板接種培養(yǎng)4</p><p>　　2.2.5 平板菌落計(jì)數(shù)4</p><p>　　2.3 電子鼻的檢測(cè)4</p>

6、<p>　　2.4.1 線性判別式分析4</p><p>　　2.4.2 主成分分析4</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論4</b></p><p>　　3.1 菌落總數(shù)測(cè)定4</p><p>　　3.2 電子鼻原始數(shù)據(jù)5</p><p>　　3.3 主成分分析7&

7、lt;/p><p>　　3.4 線性判別式分析8</p><p>　　3.5第一主成份的LDA和PCA分析9</p><p>　　3.6 Loadings分析9</p><p><b>　　4 小結(jié)10</b></p><p><b>　　致謝10</b></p&

8、gt;<p>　　摘 要：研究目的：通過(guò)電子鼻對(duì)腐敗菌的快速鑒定研究，為發(fā)展快速無(wú)損定量檢測(cè)食源性微生物提供一定研究基礎(chǔ)。</p><p>　　方法與結(jié)果：本研究利用基于金屬氧化物傳感器的電子鼻技術(shù)檢測(cè)熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）和威爾斯李斯特菌（Listeria innocua）兩種致病菌培養(yǎng)液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法主成分分析（PCA）和線性判別分

9、析（LDA）對(duì)電子鼻原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PCA模式識(shí)別結(jié)果顯示該技術(shù)能夠很好的將兩種細(xì)菌在培養(yǎng)液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物譜圖進(jìn)行區(qū)分，LDA模式可以使組間變異和組內(nèi)變異的比率達(dá)到最大，為電子鼻技術(shù)定量檢測(cè)致病菌提供了有效支撐。</p><p>　　意義：與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法相比，基于氣味指紋技術(shù)的電子鼻檢測(cè)具有高效、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。因此對(duì)這種檢測(cè)手段的應(yīng)用方法研究，對(duì)追蹤食源性疾病來(lái)源和控制食源性疾病流行具有重

10、要的意義，也是解決當(dāng)前食品安全問(wèn)題的迫切需求。</p><p>　　關(guān)鍵詞：電子鼻；腐敗菌；主成份分析；線性判別分析</p><p>　　Abstract: Aims: Through the electronic nose for rapid identification of spoilage bacteria, for the development of rapid non-des

11、tructive quantitative analysis of food-borne micro-organisms to provide a research foundation.</p><p>　　Methods and Results: In this study, we have used a metal oxide sensor based electronic nose to detect b

12、acteria Pseudomonas fluorescens and Wales Listeria monocytogenes bacteria culture fluid of two volatile metabolites, Combined with chemometric methods principal component analysis (PCA) and linear discriminant analysis (

13、LDA) on the electronic nose raw data for statistical credits. The results show that the PCA pattern recognition technique can distinguish spectra of volatile metabolites, LDA mo</p><p>　　Significance : Compa

14、red with traditional microbiological testing methods, based on electronic nose odor detection fingerprint technology is an efficient, rapid and simple features. Therefore, the application of this method of testing means,

15、 for tracking and control of foodborne illness from food-borne epidemics is of great significance, but also solve the urgent needs of food safety issues.</p><p>　　Keywords: Electronic nose; spoilage bacteria

16、; principal component analysis; linear discriminant analysis</p><p><b>　　0 引言</b></p><p>　　近年來(lái)我國(guó)食品安全問(wèn)題日趨嚴(yán)峻，食品細(xì)菌性中毒占各種食物中毒之首，食源性致病菌導(dǎo)致的疾病已經(jīng)成為危害食品安全問(wèn)題的最主要原因之一。其中熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）

17、可以從傷口、痰、胸水、尿和血液中分離出來(lái)，可導(dǎo)致輸血后不可逆的休克，具有臨床意義；威爾斯李斯特菌（L. innocua）細(xì)菌會(huì)引起大腸癌和乳腺癌等疾病。這些食源性疾病主要是通過(guò)被污染的食物和水源等而感染，因此建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)追蹤食源性疾病來(lái)源和控制食源性疾病流行具有重要的意義，也是解決當(dāng)前食品安全問(wèn)題的迫切需求[1]。</p><p>　　微生物的檢測(cè)方法較多，傳統(tǒng)方法依靠微生物的培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)生理生

18、化實(shí)驗(yàn)，但耗時(shí)長(zhǎng)效率低敏感性差，不能及時(shí)檢出樣品中的病原菌?，F(xiàn)代免疫學(xué)和分子學(xué)等方法主要針對(duì)微生物的蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行檢測(cè)，特異性效率高，但是這些方法往往需要對(duì)微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)或者細(xì)胞壁提取DNA等，樣品預(yù)處理過(guò)程比較復(fù)雜，而且達(dá)不到實(shí)時(shí)檢測(cè)的目的[2]。</p><p>　　1982年英國(guó)Warwick大學(xué)的Persuad和Dodd模仿哺乳動(dòng)物嗅覺(jué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機(jī)理提出了電子鼻的概念，電子鼻又稱(chēng)氣味掃描儀、人工嗅

19、覺(jué)分析系統(tǒng)，是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種實(shí)現(xiàn)快速分析氣味的新穎儀器，有一定選擇性的電化學(xué)傳感器陣列和適當(dāng)?shù)哪Ｊ阶R(shí)別系統(tǒng)組成，能夠識(shí)別簡(jiǎn)單和復(fù)雜氣味的儀器，其工作原理類(lèi)似人的鼻子，故稱(chēng)之為“電子鼻”。</p><p>　　基于氣味指紋技術(shù)的電子鼻檢測(cè)方法主要是針對(duì)微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物,對(duì)樣品本身沒(méi)有什么特殊要求, 無(wú)需對(duì)樣品本身進(jìn)行任何處理,具有檢測(cè)迅速、靈敏度高、使用壽命長(zhǎng)、成本低廉，因而在微生物快速無(wú)損檢

20、測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物（Microbial Volatile Organic Compounds,MVOCs）是微生物代謝產(chǎn)物的重要組成部分，是重要的信息素，也是人類(lèi)了解微生物生命活動(dòng)本質(zhì)規(guī)律的重要窗口[3]。不同微生物個(gè)體的MVOCs往往不同，它們一般具有種屬特征，因此這些氣味物質(zhì)以及由它們組成的氣味指紋圖譜可以潛在的被用來(lái)作為微生物鑒定與檢測(cè)的依據(jù)。早期研究中，學(xué)者們主要利用頂空技術(shù)結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜儀（GC

21、-MS）對(duì)微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，然而由于GC-MS技術(shù)對(duì)操作要求比較高，前期處理相對(duì)復(fù)雜等，這逐步阻礙了它們對(duì)微生物氣味指紋的研究[4]。最近，Pavlou等人運(yùn)用電子鼻技術(shù)區(qū)分了14株梭菌屬細(xì)菌和12株Bacteroides fragilis細(xì)菌的氣味指紋；在國(guó)內(nèi)，疍勛濤等人利用自己開(kāi)發(fā)的氣味濃縮電子鼻提高了兩株病原菌的區(qū)分能力，表明電子鼻技術(shù)在微生物快</p><p>　　另外由于不同種類(lèi)的細(xì)菌菌體

22、所含的酶系統(tǒng)不同, 從而分解能力不同造成其代謝產(chǎn)物不同。另外,由于細(xì)菌生長(zhǎng)要經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期四個(gè)階段，所以對(duì)同一細(xì)菌的不同生長(zhǎng)階段,揮發(fā)物的濃度也有差異。也就是說(shuō)在同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間后,對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的利用情況和所產(chǎn)生的產(chǎn)物就會(huì)不同。</p><p>　　電子鼻主要由氣敏傳感器陣列、信號(hào)處理系統(tǒng)和模式識(shí)別系統(tǒng)等功能器件組成，如下圖一所示。在電子鼻系統(tǒng)中，氣敏傳感器陣列是整個(gè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，具有不

23、同的選擇性，利用其對(duì)多種氣體的交叉敏感性，將不同的氣味分子在其表面轉(zhuǎn)化為可測(cè)定的電信號(hào)，實(shí)現(xiàn)混合氣體分析[7]。目前電子鼻傳感器的主要類(lèi)型有導(dǎo)電型傳感器、壓電式傳感器、場(chǎng)效應(yīng)傳感器、光纖傳感器等，最常用的氣敏傳感器的材料為金屬氧化物、高分子聚合物材料、壓電材料等。在信號(hào)處理系統(tǒng)中的模式識(shí)別部分主要采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別。</p><p>　　電子鼻的工作原理的類(lèi)似于人體嗅覺(jué)系統(tǒng)，按照人的嗅覺(jué)形成過(guò)程，電子

24、鼻對(duì)氣味的分析識(shí)別過(guò)程包含三個(gè)部分：（1）氣敏傳感器陣列與氣味分子反應(yīng)后，通過(guò)一系列物理化學(xué)變化產(chǎn)生電信號(hào)；（2）電子信號(hào)經(jīng)過(guò)電子線路，將信號(hào)放大并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；（3）處理后的信號(hào)通過(guò)模式識(shí)別系統(tǒng)，最后定性或者定量的輸出對(duì)氣體所含成分的檢測(cè)結(jié)果[8]。</p><p>　　本研究利用基于金屬氧化物傳感器的電子鼻技術(shù)檢測(cè)熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L.

25、innocua）兩種致病菌培養(yǎng)液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法主成分分析（PCA）和線性判別分析（LDA）對(duì)電子鼻原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PCA模式識(shí)別結(jié)果顯示該技術(shù)能夠很好的將兩種細(xì)菌在培養(yǎng)液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物譜圖進(jìn)行區(qū)分，LDA模式可以使組間變異和組內(nèi)變異的比率達(dá)到最大，為電子鼻技術(shù)定量檢測(cè)致病菌提供了有效支撐[9]。</p><p><b>　　1． 材料和方法</b></

26、p><p><b>　　1.1 原料和試劑</b></p><p>　　菌種：熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）</p><p>　　牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（又稱(chēng)營(yíng)養(yǎng)肉湯，用于培養(yǎng)細(xì)菌）</p><p>　　成分：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，p

27、H7.4</p><p>　　牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（又稱(chēng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)細(xì)菌）</p><p>　　成分：牛肉膏3g,蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7.4</p><p><b>　　碎冰</b></p><p><b>　　1.2 儀器和設(shè)備</b><

28、;/p><p><b>　　電子鼻儀器</b></p><p><b>　　電子分析天平</b></p><p><b>　　高壓蒸汽滅菌鍋</b></p><p><b>　　無(wú)菌操作臺(tái)</b></p><p><b>　　

29、電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱</b></p><p><b>　　低溫冷凍箱</b></p><p>　　其他：培養(yǎng)皿，滴定管，鑰匙，泡沫箱，燒杯，量筒（250ml），錐形瓶（500ml），移液槍?zhuān)?.5-10μl;10-100μl;100-1000μl）,槍頭，酒精燈，涂玻棒，簽字筆，接種環(huán)，保鮮膜，一次性手套，酒精燈等</p><p>&

30、lt;b>　　2. 方法</b></p><p>　　2.1 培養(yǎng)基的制備</p><p>　　2.1.1 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基制備</p><p>　　制法：將1.5g牛肉膏，5g蛋白胨，2.5氯化鈉和500ml蒸餾水各成分按照配方比例溶解于水中，以1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH為7.4，分裝三角瓶（分裝量以三角瓶容積的1/2到2/3為宜）或

31、試管（分裝至試管高度1/4左右為宜）。本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)基分裝于50ml三角瓶?jī)?nèi)。</p><p>　　2.1.2 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制備</p><p>　　制法：將1.5牛肉膏，5g蛋白胨，2.5g氯化鈉，7.5g瓊脂和500ml蒸餾水各成分溶解于水中，以1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH為7.4。</p><p>　　2.1.3 滅菌過(guò)程</p>&

32、lt;p>　　本實(shí)驗(yàn)所用高壓蒸汽滅菌鍋采用0.1Mpa，121℃，20min滅菌條件。</p><p>　　（1）首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。</p><p>　　（2）放回內(nèi)層鍋，并裝入上述培養(yǎng)基和平皿板。</p><p>　　（3）加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱(chēng)的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺

33、栓，使螺栓松緊一致，防止漏氣。</p><p>　?。?）用電驢加熱，并同時(shí)打開(kāi)排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。帶冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力所需時(shí)間。</p><p><b>　　2.1.4 倒平板</b></p><p>　　右手持盛培養(yǎng)基的500ml錐

34、形瓶放置火焰旁邊，用左手將試管塞輕輕拔出，錐形瓶口保持對(duì)著火焰；</p><p>　　然后用右手手掌邊緣或小指與無(wú)名指夾住瓶塞。左手持培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開(kāi)一縫，迅速倒入平皿</p><p>　　板約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平</p><p>　　板。最后用保鮮膜密封平皿板，隔絕外面空氣，防止雜菌

35、污染。</p><p><b>　　2.2 菌種的準(zhǔn)備</b></p><p>　　2.2.1 菌種活化</p><p>　　在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)操作，使用前打開(kāi)無(wú)菌室紫外燈輻照滅菌30分鐘以上，并且同時(shí)打開(kāi)超凈臺(tái)進(jìn)行吹風(fēng)。紫外燈輻照滅菌后，將接種環(huán)灼燒，冷卻，挑取少量上述菌種于50ml液體培養(yǎng)基內(nèi)，熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威

36、爾斯李斯特菌（L. innocua），置于30℃的電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)隔夜培養(yǎng)。</p><p><b>　　2.2.2 涂布</b></p><p>　　將上述兩種菌液用100到1000μl的移液槍分別吸取1ml原始菌液與固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕地來(lái)回推動(dòng)，使之均勻分布，然后改變90°沿另一條直

37、線來(lái)回推動(dòng)，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次，室溫下靜置5到10min。標(biāo)注威爾斯菌和熒光假單胞桿菌，置于30℃的電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)隔夜培養(yǎng)。</p><p>　　2.2.3 液體接種</p><p>　　用接種環(huán)挑取平板上單個(gè)菌落于20ml液體培養(yǎng)基，標(biāo)注熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua），置于30℃的電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)隔夜培

38、養(yǎng)。</p><p>　　2.2.4 平板接種培養(yǎng)</p><p>　　將事先滅菌密封的平皿板用記號(hào)筆分別標(biāo)明10-1，10-3 ，10-5，10-7的熒光假單胞桿菌（P. fluorescens），威爾斯李斯特菌（L. innocua）和實(shí)驗(yàn)日期等。采用梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法，即在無(wú)菌水平凈化臺(tái)里，用100μl移液槍吸取100μl的菌液，加入900μl的滅菌生理水，制成1：10的均稀釋液，再

39、依次進(jìn)行l(wèi)00倍遞增稀釋?zhuān)吝m當(dāng)稀釋度10-3 ，10-5和10-7后，采用平板劃線分離法劃線：用無(wú)菌接種環(huán)挑取上述配置液在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。每個(gè)梯度做一個(gè)平行。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于30℃的電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)隔夜培養(yǎng)。</p><p>　　2.2.5 平板菌落計(jì)數(shù)</p><p>　　取出隔夜培養(yǎng)的10-3 ，10-5，10-7三個(gè)梯度共12個(gè)熒光假單胞桿菌（P. fl

40、uorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）平板，然后測(cè)定兩個(gè)菌的菌體數(shù)量，根據(jù)大部分菌體量在100到200且比較分散，采用全部計(jì)數(shù)；其余采用平均四份，取其中一塊×4，得到菌體數(shù)量。</p><p><b>　　計(jì)算公式：</b></p><p>　　每毫升樣品中菌落形成單位數(shù)（CFU）=同一稀釋度2次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)&l

41、t;/p><p>　　根據(jù)所得菌落形成單位數(shù)，吸取一定量菌液于液體培養(yǎng)基，標(biāo)注威1，威2，威3，熒1，熒2，熒3和空白培養(yǎng)基置于30℃的電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)隔夜培養(yǎng)。</p><p>　　2.3 電子鼻的檢測(cè)</p><p>　　電子鼻采用靜態(tài)頂空氣方法對(duì)樣品進(jìn)行分析。首先將裝好樣的樣品瓶進(jìn)行加熱振蕩使樣品在瓶中迅速達(dá)到多相平衡，接著由自動(dòng)進(jìn)樣器抽取樣品瓶中頂空的部分氣

42、體并直接打入傳感器箱，最后通過(guò)傳感器與樣品氣體進(jìn)行反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中電子鼻參數(shù)具體如下：菌液濃度1.5×109 cfu/g，信號(hào)總獲取時(shí)間100s，信號(hào)頻率1.0s，載氣為合成干燥空氣，載氣流速300mL/min，進(jìn)樣體積2mL,溫度常溫。</p><p><b>　　2.4 數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　2.4.1 線性判別式分析</p>

43、<p>　　線性判別分析是一種常用的分類(lèi)方法，使用該方法需要樣本空間呈正態(tài)分布，并有相等的離差。構(gòu)造的判別函數(shù)由原始變量經(jīng)線性組合得出，能夠最大限度地區(qū)分不同的樣本集，在降低數(shù)據(jù)空間維數(shù)的同時(shí)最大限度地減少信息丟失。這種數(shù)學(xué)分類(lèi)規(guī)劃則將N維空間分成一些子空間，并將其定義在直線、平面或超平面上。這種計(jì)算判別函數(shù)的方法可以使組間變異與組內(nèi)變異的比率最大。由于LDA具有分類(lèi)效果好、易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，所以成為在電子鼻系統(tǒng)中應(yīng)用十分廣泛的

44、方法，并都取得了良好的效果。</p><p>　　2.4.2 主成分分析</p><p>　　主成分分析是將所提取的傳感器多指標(biāo)的信息進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對(duì)降維后的特征向量進(jìn)行線性分類(lèi)，最后在PCA分析的散點(diǎn)圖上顯示主要的兩維散點(diǎn)圖。PCA1和PCA2上包含了在PCA轉(zhuǎn)換中得到的第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率。貢獻(xiàn)率越大，說(shuō)明主要成分可以較好的反映原來(lái)多指標(biāo)的信息。一般情況下，總貢獻(xiàn)率超

45、過(guò)70%到80%的 方法即可使用[10-12]。</p><p><b>　　3. 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 菌落總數(shù)測(cè)定</p><p>　　根據(jù)以下原則計(jì)數(shù)菌落總數(shù)：菌落總數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的

46、倍數(shù)來(lái)表示。如下表1顯示的是不同稀釋度的熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）的菌落總數(shù)。</p><p><b>　　計(jì)算方法：</b></p><p>　　涂布平板計(jì)數(shù)法：cfu數(shù)/ml(g)樣品=同一稀釋度兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)</p><p>　　表1熒光假單胞桿菌（

47、P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）的菌落總數(shù)</p><p>　　Table 1 the total plate count of P. fluorescens and L. innocua</p><p>　　由上述表格得出威爾斯李斯特菌（L. innocua）的菌落總數(shù)為（145+140）/2×107=1.4×109</p&

48、gt;<p>　　熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）的總數(shù)為（137+136）/2×107=1.4×109</p><p>　　通過(guò)菌落總數(shù)可以得出熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）的菌液體細(xì)菌的濃度在109cfu/ml左右。</p><p>　　此目的在于消除周?chē)h(huán)境對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，主要是

49、消除菌落數(shù)量多少的不同對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。因此在后續(xù)步驟中將培養(yǎng)好的菌液分裝到10ml的培養(yǎng)瓶中，取樣量為2ml/瓶，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行重復(fù)。以上操作對(duì)兩個(gè)菌都一樣。</p><p>　　3.2 電子鼻原始數(shù)據(jù)</p><p>　　對(duì)各個(gè)樣品依次用電子鼻進(jìn)行檢測(cè)，得到各樣品的電子鼻輸出信號(hào)與采集時(shí)間的關(guān)系。以威爾斯李斯特菌（L. innocua）1號(hào)樣品為例，圖1為各個(gè)傳感器對(duì)同一樣品威爾斯

50、菌的響應(yīng)曲線。</p><p>　　圖1 威爾斯李斯特菌（L. innocua）的10根傳感器的響應(yīng)曲線</p><p>　　Figure 1 the ten sensor response curve of L. innocua</p><p>　　圖2熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）的10根傳感器的響應(yīng)曲線</p><p>

51、　　Figure 2 the ten sensor response curve of P. fluorescens</p><p>　　實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每個(gè)樣品時(shí)，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為100秒，共有10根傳感器。圖中橫軸為時(shí)間軸，共100秒，縱軸為響應(yīng)強(qiáng)度，每條曲線代表一個(gè)傳感器在100秒內(nèi)的相應(yīng)值變化[13-14]。從圖1中可以看出，隨著采集時(shí)間的延長(zhǎng)，傳感器1到10的輸出信號(hào)逐漸變化，由圖明顯可以看出威爾斯李斯特菌大致在

52、20秒時(shí)候達(dá)到最大相應(yīng)值，在80秒后逐漸趨于穩(wěn)定。在其它培養(yǎng)瓶下的同種菌液，用電子鼻進(jìn)行檢測(cè)，得到的電子鼻輸出信號(hào)與采集時(shí)間關(guān)系和圖1類(lèi)似。</p><p>　　圖2顯示的是各個(gè)傳感器樣品對(duì)熒光假單胞桿菌的響應(yīng)曲線。與圖1比較可以發(fā)現(xiàn)兩者存在明顯區(qū)別，該菌是在40秒時(shí)達(dá)到最大響應(yīng)值，然后趨于穩(wěn)定。</p><p>　　表2 傳感器及其對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)類(lèi)型</p><p

53、>　　Table 2 Sensor and its corresponding type of volatile substances</p><p>　　表2是該電子鼻的傳感器及其對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)類(lèi)型，與圖1和圖2相對(duì)應(yīng)，可以看出威爾斯李斯特菌（L. innocua）對(duì)W5S和W1S比較敏感，而熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）對(duì)W5S和W2S比較敏感，說(shuō)明兩組樣品之間的揮發(fā)性物質(zhì)強(qiáng)度存在差異

54、。</p><p>　　各個(gè)傳感器輸出信號(hào)隨采集時(shí)間變化而變化的趨勢(shì)反映的是各傳感器對(duì)氣味的敏感程度，也蘊(yùn)含了電子鼻測(cè)試樣品時(shí)所獲得的總體信息。通過(guò)各個(gè)傳感器響應(yīng)強(qiáng)度值信息的比較，如下圖3熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）在100秒傳感器的相應(yīng)值，清晰說(shuō)明從傳感器信號(hào)響應(yīng)值的不同可以判斷兩組樣品之間的揮發(fā)性物質(zhì)強(qiáng)度存在差異。</p><p&g

55、t;　　圖3從左到右是威爾斯李斯特菌（L. innocua）和熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）在100秒時(shí)傳感器的相應(yīng)值</p><p>　　Figure 3 L. innocua and P. fluorescens from left to right is the 100 seconds corresponding values ??of the sensor</p><p

56、>　　經(jīng)過(guò)比較我們可以得出以下結(jié)論：</p><p>　　第一，不同的傳感器對(duì)同一樣品的響應(yīng)曲線是不同的，說(shuō)明每根傳感器對(duì)樣品的響應(yīng)具有選擇性。</p><p>　　第二，同一傳感器對(duì)不同樣品的敏感性存在差異，比如W5S在威爾斯李斯特菌（L. innocua）的信號(hào)相應(yīng)值強(qiáng)度最大為7.0而在熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）的信號(hào)響應(yīng)值強(qiáng)度最大為3.4，而且兩者最大相應(yīng)值

57、時(shí)間也不同。</p><p>　　綜上得出不同傳感器對(duì)不同樣品反應(yīng)的敏感程度不同。同時(shí)，從傳感器信號(hào)的不同也可以判斷威爾斯李斯特菌（L. innocua）和熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）樣品之間的揮發(fā)性物質(zhì)強(qiáng)度存在差異[15]。</p><p><b>　　3.3 主成分分析</b></p><p>　　主成分分析主要是將傳感器

58、響應(yīng)的特征向量矩陣進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對(duì)降維后的特征向量進(jìn)行線性分類(lèi)，最后將分類(lèi)結(jié)果以PCA散點(diǎn)圖的形式展現(xiàn)出來(lái)。其基本思想是將眾多的變量重新組合成一組新的互相無(wú)關(guān)的幾個(gè)綜合變量，同時(shí)根據(jù)實(shí)際需要從中取出幾個(gè)較少的總和變量并盡可能多地反映原來(lái)變量的信息。因此，前幾個(gè)主成分如第一個(gè)主成份（PC1）和第二個(gè)主成份（PC2）基本包含了傳感器的響應(yīng)結(jié)果。</p><p>　　圖4為氣味指紋圖的分析信息，圖5為威爾斯李斯

59、特菌（L. innocua）和熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）以及空白培養(yǎng)液的氣味指紋PCA圖。</p><p>　　圖4 氣味指紋圖的分析信息</p><p>　　Figure 4 Analysis of odor fingerprint information</p><p>　　圖5威爾斯李斯特菌（L. innocua），熒光假單胞桿菌（P. f

60、luorescens）和空白培養(yǎng)液氣味指紋PCA圖</p><p>　　Figure 5 the odor fingerprint PCA map of L. innocua， P. fluorescens and blank medium</p><p>　　從圖5可以看出威爾斯李斯特菌（L. innocua）和熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）兩種樣品的三個(gè)重復(fù)點(diǎn)能夠很好的

61、聚在一起形成一個(gè)個(gè)組群，進(jìn)一步表明分析的重復(fù)性合格。其中縱坐標(biāo)第一主成份為74.625%，橫坐標(biāo)第二主成份為20.251%，整體上講，第一主成份和第二主成份之和為94.876%，總貢獻(xiàn)率超過(guò)70%，表明區(qū)分合格。</p><p>　　從第二主成份上看，從左到右依次為空白培養(yǎng)液、熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）培養(yǎng)液和威爾斯李斯特菌（L. innocua）培養(yǎng)液；而且從第一主成份上看，兩種菌和空白培養(yǎng)

62、液有明顯三個(gè)層次。表明熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）培養(yǎng)液和威爾斯李斯特菌（L. innocua）培養(yǎng)液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出不同的釋放。結(jié)合圖4的分析結(jié)果也可以進(jìn)一步驗(yàn)證：基于微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的研究對(duì)微生物的區(qū)分是可行也是有效的。</p><p>　　3.4 線性判別式分析</p><p>　　線性判別是一種常用的分類(lèi)方法，由原始變量經(jīng)線性組合構(gòu)造出判別函數(shù)，能夠最

63、大限度地區(qū)分不同的樣本集，在降低數(shù)據(jù)空間維數(shù)的同時(shí)，最大限度地減少信息丟失。</p><p>　　對(duì)空白培養(yǎng)液、熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）培養(yǎng)液和威爾斯李斯特菌（L. innocua）培養(yǎng)液進(jìn)行LDA分析，如圖6所示，其總貢獻(xiàn)率達(dá)到99.948%，其中第一主成份為53.075%，第二主成份為46.874%，大于PCA散點(diǎn)圖的94.876%。與PCA相比較威爾斯李斯特菌（L. innocua）和

64、熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）兩種樣品的三個(gè)重復(fù)點(diǎn)集中，從左到右依次為空白培養(yǎng)液、威爾斯李斯特菌（L. innocua）和熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）培養(yǎng)液，且比PCA區(qū)分度高，這表明熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）的區(qū)域沒(méi)有交叉，采用LDA法也能很好的反映兩種菌液的揮發(fā)性物質(zhì)存在明顯差異，特別在第二主成份上更顯著。</p><p

65、>　　圖6熒光假單胞桿菌（P. fluorescens），威爾斯李斯特菌（L. innocua）和空白培養(yǎng)液氣味指紋LDA圖</p><p>　　Figure 6 the odor fingerprint LDA map of L. innocua， P. fluorescens and blank medium</p><p>　　3.5第一主成份的LDA和PCA分析</p&

66、gt;<p>　　分別用LDA法和PCA法對(duì)熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）以及空白培養(yǎng)液的第一主成份進(jìn)行分析[16]，即圖5和圖6的縱坐標(biāo)比較可以得出結(jié)果，如圖7</p><p>　　圖7左圖是LDA，右圖是PCA</p><p>　　Figure 7 left is LDA, the right is PCA</

67、p><p>　　通過(guò)比較我們可以得出LDA第一主成分的響應(yīng)強(qiáng)度明顯呈現(xiàn)3個(gè)梯度，威爾斯李斯特菌（L. innocua）能夠很好的與熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和空白培養(yǎng)液區(qū)分開(kāi)，而熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和空白培養(yǎng)液區(qū)的第一主成份區(qū)別差異相對(duì)比較小。相對(duì)而言PCA第一主成份的響應(yīng)強(qiáng)度存在明顯區(qū)域。通過(guò)比較我們可以得出：熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特

68、菌（L. innocua）的揮發(fā)性物質(zhì)的強(qiáng)度也存在明顯差異。</p><p>　　3.6 Loadings分析</p><p>　　利用Loadings分析可以幫助區(qū)分當(dāng)前模式下傳感器的相對(duì)重要性，傳感器貢獻(xiàn)率越高，則該傳感器的識(shí)別能力越強(qiáng)[17]，見(jiàn)圖8</p><p>　　圖8熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）

69、的Loadings分析</p><p>　　Figure 8 the loadings analysis of P. fluorescens and L. innocua</p><p>　　從圖8中我們可以看出電子鼻的10個(gè)傳感器，基本上對(duì)熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）的揮發(fā)性物質(zhì)都有響應(yīng)，其中傳感器W5S對(duì)第一主成份貢獻(xiàn)率最大，W

70、1S，W2S和W2W對(duì)第二主成份的貢獻(xiàn)率比較大，W6S,W3S,W1C，W3C和W5C對(duì)兩個(gè)主成份貢獻(xiàn)率差不多。由表2可知，傳感器W5S主要對(duì)氮氧化合物比較靈敏，W1S主要對(duì)甲烷比較靈敏，W2S主要對(duì)乙醇比較靈敏。因此，綜合分析得出熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要是氮氧化合物、乙醇類(lèi)和芳香型化合物。兩者在揮發(fā)性代謝產(chǎn)物上區(qū)別不是很大。</p><

71、;p><b>　　4. 小結(jié)</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用金屬氧化物氣敏傳感器檢測(cè)了熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）兩種細(xì)菌在培養(yǎng)液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，同時(shí)以空白培養(yǎng)液作比較。通過(guò)主成份分析，線性判別式分析并結(jié)合Loadings分析對(duì)傳感器相應(yīng)值進(jìn)行識(shí)別和分析，結(jié)果表明：基于氣味指紋的電子鼻技術(shù)能夠較好的區(qū)分熒光假單胞桿菌

72、（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）兩種細(xì)菌培養(yǎng)液，利用Loadings分析得出兩種菌的主揮發(fā)性答謝產(chǎn)物區(qū)別不大，傳感器W5S對(duì)第一主成份貢獻(xiàn)率最大，W1S，W2S和W2W對(duì)第二主成份的貢獻(xiàn)率比較大，表明兩種菌的主要揮發(fā)性氣體是氮氧化合物、乙醇類(lèi)和芳香型化合物。因此，根據(jù)線性判別式分析和主成份分析得出熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）培養(yǎng)液的揮發(fā)性物

73、質(zhì)主要在強(qiáng)度相應(yīng)值存在明顯差異，PCA和LDA方法同時(shí)顯示兩種細(xì)菌的氣味和響應(yīng)強(qiáng)度與空白培養(yǎng)液有一定差異，并且根據(jù)第一主成份分析表明熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）的氣味信息與空白培養(yǎng)液接近，而威爾斯李斯特菌（L. </p><p>　　雖然熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）和威爾斯李斯特菌（L. innocua）培養(yǎng)液能區(qū)別空白培養(yǎng)液，但其是否能區(qū)別其它所有的食源性致病菌尚缺乏比較，另

74、一方面，本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)純培養(yǎng)的菌做了檢測(cè)，未曾具體用于食品微生物的檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過(guò)電子鼻對(duì)腐敗菌的快速鑒定研究，為發(fā)展快速無(wú)損定量檢測(cè)食源性微生物提供一定研究基礎(chǔ)。</p><p>　　相對(duì)于傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法，電子鼻用于微生物的檢測(cè)基于氣味指紋的檢測(cè)技術(shù)，其主要針對(duì)于微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，對(duì)樣品沒(méi)有特殊的要求，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)時(shí)短靈敏度高，最重要的是在操作過(guò)程中不需要對(duì)樣品進(jìn)行任何破壞處理[18]

75、，從本次實(shí)驗(yàn)中也可以看出。另外，2005年，Balasubramanian等用手提式電子鼻系統(tǒng)檢測(cè)了牛肉中培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌。2008年，Siripatrawan等用電子鼻檢測(cè)新鮮蔬菜中的食源性致病菌?？梢?jiàn)，電子鼻在微生物快速檢測(cè)中是一項(xiàng)非常有發(fā)展前景的無(wú)損傷快速檢測(cè)方法[19，20]。</p><p>　　從生物分類(lèi)學(xué)角度上看，兩種腐敗菌歸屬于兩種不同屬，依次分別是熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）的假

76、單胞菌屬和威爾斯李斯特菌（L. innocua）的李斯特式菌屬。兩者在基因序列以及代謝表型上應(yīng)該是有一定差別的，因此兩種菌對(duì)空白培養(yǎng)液的利用會(huì)呈現(xiàn)差異性，從而其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物也必然存在一定差異。因此，實(shí)驗(yàn)表明基于氣味指紋的電子鼻技術(shù)具有區(qū)分微生物的潛在能力，有望在致病菌快速檢測(cè)和鑒定方面進(jìn)一步得到利用。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　

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