滅菌劑對槍烏賊優(yōu)勢腐敗菌的影響【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　滅菌劑對槍烏賊優(yōu)勢腐敗菌的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品科學(xué)與工

2、程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></

3、p><p><b>　　前言4</b></p><p><b>　　1材料與方法5</b></p><p>　　1.1原料及前處理5</p><p>　　1.2 儀器與設(shè)備6</p><p>　　1.3 藥品與試劑6</p><p>　　1.4

4、 實驗方法7</p><p>　　1.4.1優(yōu)勢菌的分離純化與鑒定7</p><p>　　1.4.1.1 優(yōu)勢菌的分離純化7</p><p>　　1.4.1.2 優(yōu)勢菌鑒定7</p><p>　　1.4.1.3 優(yōu)勢菌的培養(yǎng)9</p><p>　　1.4.2 抑菌劑最小抑菌濃度測定9</p>

5、<p>　　1.4.2.1 Shewanella sp.ANA-3菌懸液的制備9</p><p>　　1.4.2.2最低抑菌濃度( MIC ) 的測定9</p><p>　　1.4.3 抑菌劑交互作用及最佳抑菌組合方案10</p><p>　　1.4.3.1 抑菌實驗10</p><p>　　1.4.3.2 正交實驗設(shè)計1

6、0</p><p>　　2 結(jié)果與討論10</p><p>　　2.1 優(yōu)勢菌鑒定10</p><p>　　2.2 抑菌劑最小抑菌濃度（MIC）11</p><p>　　2.3 抑菌劑交互作用及組合方案11</p><p>　　2.3.1 實驗方法確定11</p><p>　　2.3.

7、2 正交實驗分析12</p><p><b>　　3 驗證實驗13</b></p><p><b>　　4 結(jié)論13</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)13</b></p><p>　　摘要

8、：本文以從槍烏賊中分離出的優(yōu)勢腐菌為研究對象，通過正交實驗確定最佳抑菌劑組合方案，從而有效降低槍烏賊的腐敗率。研究結(jié)果表明，希瓦氏菌ANA-3是導(dǎo)致槍烏賊腐敗的優(yōu)勢菌群，且在測得的最小抑菌濃度的基礎(chǔ)上，通過正交試驗得到最終優(yōu)化組合：在A、B、C濃度分別為1mg/ml 、0.8mg/ml與0.16mg/ml時，牛津杯抑菌實驗得到的抑制圈直徑最大，抑菌效果最佳。其中抑菌劑A、B、C以及B和D的交互作用對抑菌效果具有非常顯著的影響(P<

9、0.01),且抑菌劑A和B的交互影響也具有顯著性(P<0.05)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：槍烏賊；希瓦氏菌；抑菌劑；牛津杯 </p><p>　　Abstract: In this paper, the special spoilage bacteria was isolated from the squid to be the research object. And I d

10、ecided the appropriate combination of antibacterial agents by the orthogonal experiments to reduce the rate of corruption on squid. The research showed that Shewanella ANA-3 was the dominant microorganisms which causing

11、the corruption of squid, and on the basis of the minimum inhibitory concentration of antimicrobial agents. the final optimized combinations were found: at the leve</p><p>　　Keywords: Squid; Shewanella spp.;

12、antibacterial agent; Oxford Cup</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　魷魚，又稱槍烏賊，句公或柔魚屬于軟體動物門頭足綱管魷目開眼亞目，長約1.5公分-20公尺，是一種優(yōu)秀的海洋水產(chǎn)資源，具有重大的開發(fā)價值。其肉質(zhì)細(xì)膩，每100g槍烏賊鮮肉含蛋白質(zhì)約15g，維生素A的含量為230國際單位，約為烏賊的2倍，肉質(zhì)也較軟

13、嫩，魷魚干質(zhì)細(xì)香甜，更是海味中的珍品。</p><p>　　隨著人們生活水平的提高，海洋資源也得以進(jìn)一步的開發(fā)利用，海產(chǎn)品如槍烏賊等漸漸的因其鮮美的味道和較高的營養(yǎng)價值越來越受到人們的歡迎。然而，海產(chǎn)品因其特殊的存在環(huán)境而使得其在捕撈上來后極易腐敗變質(zhì)，失去其食用價值。而引起它們腐敗變質(zhì)的卻是微生物，相對于陸地上的動物性產(chǎn)品，海產(chǎn)品具有更高的含水量，一般在70%-80%，高含水量導(dǎo)致的高水分活度創(chuàng)造了微生物生長的

14、良好環(huán)境[1,2]。此外，海產(chǎn)品肌肉組織中肌肉蛋白的基質(zhì)蛋白含量較少，這使得它的肌肉組織更為脆弱，自溶速度快，易受損傷也易受微生物的感染[3-5]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國沿海地區(qū)生產(chǎn)的海產(chǎn)品制品每年都因微生物的作用而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)失去食用價值而損失20%左右的原料。因此，研究如何更有效的殺滅海產(chǎn)品表面的微生物[6,7]同時又不損害產(chǎn)品本身的美好風(fēng)味以達(dá)到防腐保鮮的目的已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題。</p><p>　　在

15、現(xiàn)代食品工業(yè)中，隨著殺菌設(shè)備、技術(shù)和工藝的成熟，各種新型的殺菌方式蓬勃誕生，但熱殺菌憑借成熟的工藝仍占據(jù)食品殺菌主要地位，熱殺菌根據(jù)殺菌溫度的不同，分為低溫殺菌、高溫殺菌和超高溫殺菌。相反的不以熱致死為主要機(jī)理的滅菌方法又稱非熱殺菌技術(shù)或稱冷滅菌技術(shù)，其中冷殺菌又可分為化學(xué)殺菌法和物理殺菌法。冷殺菌技術(shù)起步較晚，但現(xiàn)在社會消費(fèi)者對食品的營養(yǎng)、原汁原味等方面的呼聲日益高漲，反觀傳統(tǒng)的熱殺菌法雖然能保證食品在微生物方面的安全。但是熱能會破壞

16、對熱敏感的營養(yǎng)成分，影響食品的質(zhì)構(gòu)、色澤和風(fēng)味，因此冷殺菌技術(shù)受到日益重視并進(jìn)展很快。冷殺菌技術(shù)不僅能保證食品在微生物方面的安全，而且能較好地保持食品的固有營養(yǎng)成分、質(zhì)構(gòu)、色澤和新鮮程度，冷殺菌技術(shù)近些年來成為國內(nèi)外食品科學(xué)與工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。</p><p>　　食品的低溫殺菌指低于水的沸點(diǎn)(100℃)以下的加熱處理，故又常稱為巴氏殺菌。低溫殺菌是以殺滅所有污染食品中的致病菌為目的的熱力殺菌。經(jīng)過低溫殺菌的食

17、品，因其中尚存有非致病的腐敗芽抱菌，在常溫下增殖，因而只有有限的貨架壽命。若要貯藏，則還需要與其他保藏手段相結(jié)合。低溫殺菌也常用于pH4.5以下的酸性食品，低溫殺菌方法雖然不能殺滅他、芽孢桿菌，但因酸性環(huán)境能抑制其生長，所以低溫殺菌對于決大多數(shù)經(jīng)密封的酸性食品具有可靠的耐藏性。對于那些不耐高溫處理的低酸性食品，只要不影響消費(fèi)習(xí)慣，常利用加酸或借助于微生物發(fā)酵產(chǎn)酸的手段，使pH值降至酸性食品的范圍，就可采用低溫殺菌達(dá)到保持食品品質(zhì)和耐藏的

18、目的。</p><p>　　食品的高溫殺菌指食品經(jīng)100℃以上的殺菌處理，又稱為阿佩爾殺菌法。食品的高溫殺菌主要應(yīng)用于 pH值大于4.5的低酸性食品的殺菌。這類食品因酸度較低，能被各種致病菌、芽抱菌、產(chǎn)毒菌及其他腐敗菌污染變質(zhì)，特別是肉毒梭狀芽抱桿菌能在pH4.8以上繁殖，并能分泌毒素。因此，凡是低酸性食品都必須接受以殺死肉毒梭狀芽抱桿菌芽抱所制訂的熱力殺菌規(guī)程。考慮到肉毒梭狀芽抱桿菌為厭氧性嗜溫菌，其芽抱的耐熱

19、性較強(qiáng)，且需要?dú)缫欢ǖ臄?shù)量級才能保證食品的安全，故必須采用高溫殺菌的手段。用熱水或蒸汽作介質(zhì)殺菌時，要達(dá)到超過100℃以上的溫度，只有用高壓水或高壓蒸汽才行，所以又常有高溫高壓殺菌之稱。</p><p>　　食品的超高溫殺菌[8,9]指采用高溫、短時使液體食品中的有害微生物致死的滅菌方法，滅菌溫度一般為130-150℃，滅菌時間為數(shù)秒。習(xí)慣上將135-150℃的溫度下保溫2-8s的處理工藝稱為超高溫瞬時殺菌。大

20、多數(shù)超高溫產(chǎn)品既無活生物，也無活孢子。但某些超高溫產(chǎn)品可能仍有不會繁殖的活孢子。因此超高溫殺菌產(chǎn)品也可以叫作商業(yè)無菌產(chǎn)品，因此，這類產(chǎn)品有著比巴氏殺菌產(chǎn)品長得多的貨架壽命。超高溫產(chǎn)品的貨架壽命即使不用冷藏也可長達(dá)數(shù)周到數(shù)月。微生物對高溫的敏感性程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于食品成分的物理化學(xué)變化對高溫的敏感程度，所以熱力殺菌中，超高溫瞬時殺菌技術(shù)可最大程度地保持食品的風(fēng)味及品質(zhì)。</p><p>　　物理殺菌技術(shù)是指不借助化學(xué)殺菌

21、劑[10]，單純利用物理手段進(jìn)行殺滅微生物的殺菌技術(shù)，分為熱殺菌和非熱物理殺菌兩大類。非熱物理殺菌是一類嶄新的冷殺菌技術(shù)[11]，它在g服熱殺菌不足之處的基礎(chǔ)上，運(yùn)用物理手段，如場(包括電場、磁場)、高壓、電子、光等的單一作用或者兩種以上的共同作用，在低溫[12]或常溫下達(dá)到殺菌目的的方法。物理方法需要高級的設(shè)備資源來實現(xiàn)外部環(huán)境的改變，因此還未普及到世界范圍內(nèi)的生產(chǎn)加工中，特別是小型企業(yè)。</p><p>　　

22、食品化學(xué)殺菌技術(shù)[13,14]系指利用化學(xué)與生物藥劑達(dá)到殺死或抑制微生物生長繁殖的殺菌技術(shù)。這些具有殺菌或抑菌作用的化學(xué)與生物藥劑被稱為殺菌劑，它們是天然存在或人工合成的化學(xué)物質(zhì)[15-17]，有些則是通過某些生物體制取的，如小葉榕[18]，卡拉瑪尼科百里香[19]等。雖然部分殺菌劑具有殺死微生物的作用，但多數(shù)抑菌劑對微生物只起到抑制生長和繁殖的效果。而且殺菌劑對微生物起到的“殺死”或“抑制”作用與殺菌劑的用量和作用時間等密切相關(guān)，在劑

23、量低或作用時間短時通常是“抑制”作用，在劑量高和作用時間長時則往往具有“殺死”作用?；瘜W(xué)殺菌劑數(shù)量大、種類多，且其結(jié)構(gòu)、來源、性質(zhì)、效能和用途等方面都有很大的差異，在食品工業(yè)中多數(shù)用于水、加工設(shè)備和環(huán)境殺菌消毒，只有少部分無害或危害極小的殺菌劑可直接作為食品添加劑來防腐保鮮食品[20]。根據(jù)殺菌劑結(jié)構(gòu)類型及用途不同，可以把殺菌劑分為以下幾種類型:(l)鹵素系殺菌劑，例如:氯、二氧化氯、次氯酸納、漂白粉等。(2)氧化劑類殺菌劑，例如:過氧

24、化氫、過氧乙酸、臭氧等。(3)表面活性劑殺菌劑，例如:新潔爾滅、度米芬、消毒凈等。(4)雜環(huán)類氣體殺菌劑，例如:環(huán)氧乙烷</p><p>　　本文旨在尋找槍烏賊表面的腐敗微生物，在此基礎(chǔ)上針對少數(shù)特定的已知微生物選用合適的滅菌劑，實現(xiàn)對槍烏賊表面腐敗微生物的滅殺，實現(xiàn)產(chǎn)品的防腐保鮮，延長其保藏期。本次試驗在有針對性的情況下可以選用少量幾種安全綠色的滅菌劑完成對特定腐敗菌的滅殺，解決了滅菌劑易殘留，不安全的隱患，對

25、槍烏賊產(chǎn)品的防腐有較好的效果。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1原料及前處理</b></p><p>　　凍藏槍烏賊，某水產(chǎn)品企業(yè)提供，選擇厚度較大的胴體部分作為研究對象。在無菌環(huán)境中將凍藏槍烏賊的胴體部分切割成約為20cm2、厚度約為2cm的肌肉組織塊以備用。</

26、p><p><b>　　1.2 儀器與設(shè)備</b></p><p><b>　　1.3 藥品與試劑</b></p><p><b>　　1.4 實驗方法</b></p><p>　　1.4.1 優(yōu)勢菌的分離純化與鑒定</p><p>　　1.4.1.1 優(yōu)勢

27、菌的分離純化</p><p>　　在前面實驗的基礎(chǔ)上，對分離得到的優(yōu)勢菌進(jìn)行多次分離劃線，提純培養(yǎng)。待菌株純化后，接種于試管斜面，在4℃下保存以備鑒定。</p><p>　　1.4.1.2 優(yōu)勢菌鑒定</p><p>　　菌落形態(tài)觀察：觀察己分離純化的單個菌落的大小、光澤度、透明度、顏色、邊緣結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)等。</p><p>　　生理生化試

28、驗：細(xì)菌菌相鑒定按圖1、圖2所示菌種鑒定方法進(jìn)行鑒定。鑒定試驗主要包括鞭毛染色，芽孢染色，運(yùn)動性實驗，氧化酶試驗，過氧化氫酶試驗，O/F實驗，糖發(fā)酵試驗，耐鹽生長試驗，產(chǎn)H2S實驗，O/129敏感性試驗等，具體實驗方法如下。</p><p><b>　　G+菌</b></p><p>　　球菌 桿菌<

29、;/p><p>　　H2O2(+) H2O2(-) </p><p>　　葡萄糖可以發(fā)酵 葡萄糖不能發(fā)酵 同型發(fā)酵 異型發(fā)酵 </p><p>　　staphylococcus micrococcus streptococcu

30、s leuconostoc</p><p>　　無芽孢，非運(yùn)動性 芽孢，運(yùn)動性</p><p>　　H2O2(+) H2O2(-) 需氧及兼性厭氧菌 專性厭氧菌</p><p>　　形成菌絲體 不能形成菌絲體 lactobacillus bacil

31、lus clostridium</p><p>　　streptomyces 能變?yōu)榍蚓?不能從桿菌變?yōu)榍蚓?lt;/p><p>　　or nocardia </p><p>　　arthrubacter corynebacterium </p><p>　　圖1中革蘭氏陽性菌鑒定圖</p>&

32、lt;p>　　Fig.1 Identification procedures of Gram positive microorganism</p><p><b>　　G-菌</b></p><p>　　有鞭毛 無鞭毛</p><p>　　端生鞭毛

33、 周生鞭毛</p><p>　　氧化酶陽性 氧化酶陽性 可以形成黃、 不能產(chǎn)生</p><p>　　葡萄糖不能發(fā)酵 葡萄糖能發(fā)酵 橙、赤色 菌體色素</p><p>　　有附著柄 無附著柄 flavobacterium</p>

34、;<p>　　caulobacter pseudomonas 氧化酶陰性 氧化酶陽性</p><p>　　遲發(fā)性陽性 </p><p>　　糖類不產(chǎn)氣 糖類產(chǎn)氣 enterobacteriaceae</p><p>　　通常菌體彎曲 多數(shù)為短桿菌

35、 achromobacter</p><p>　　vibrio aeromonas</p><p>　　可以形成黃、橙、赤色 不能產(chǎn)生菌體色素</p><p>　　非彎曲性桿菌 細(xì)長彎曲性細(xì)胞 葡萄糖能發(fā)酵 葡萄糖不能發(fā)酵&l

36、t;/p><p>　　不能運(yùn)動移動 可以運(yùn)動移動</p><p>　　aeromonas acinetobacter flavobacterium cytophaga or vibrio </p><p>　　圖2中革蘭氏陰性菌鑒定圖</p><p>　　Fig.2

37、Identification procedures of Gram negtive microorganism</p><p>　　革蘭氏染色試驗：選取實驗中分離的菌種進(jìn)行常規(guī)涂片、干燥、固定等操作，在載玻片上對菌種進(jìn)行滴加結(jié)晶紫初染實驗，染色1 min～2 min后用水沖洗；完了之后用碘液沖去殘水，同時用碘液覆蓋初染后的菌種約1 min后，用水沖洗，再用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜后于白色背景等強(qiáng)對比底色下

38、用滴管加95%的乙醇沖洗脫色，直至流出的乙醇無明顯紫色，趨于透明后立即水洗；最后用番紅液對菌種進(jìn)行為時約2 min的復(fù)染，用水沖洗；干燥后置于顯微鏡油鏡下觀察，若菌體最終被染成藍(lán)紫色則鑒定為革蘭氏陽性菌，最終被染成紅色的則鑒定為革蘭氏陰性菌。</p><p>　　鞭毛染色試驗：又稱硝酸銀染色法，要求選用處于生長活躍期的菌種。取一滴菌液滴于載玻片一端，然后將玻片傾斜放置使菌液緩緩流向載玻片的另一端，之后用吸水紙吸去

39、玻片下端剩下的多余菌液，在室溫下（或37℃）使其自然干燥。等干燥完成后立即開始染色操作，用滴管滴加硝酸銀染色液A液覆蓋干燥后的菌液染色3 min～5 min，之后用蒸餾水沖洗，要求充分洗去A液。接下來用硝酸銀染色液B液沖去殘水，再用B液覆蓋載玻片染色，此過程持續(xù)數(shù)秒到1 min，當(dāng)涂面出現(xiàn)明顯褐色時立即用蒸餾水沖洗（在這過程中可能因為加了B液后而使顯色過程出現(xiàn)較慢，這時可用微火稍作加熱，加速褐色顯現(xiàn)），室溫下等待其自然干燥；然后于顯微鏡

40、油鏡下觀察，菌體最終呈現(xiàn)深褐色，鞭毛呈現(xiàn)褐色而且通常呈波浪形。（實驗中用到的AB液分別為：A液，F(xiàn)eCl31.5 g、單寧酸5 g、1.0 %NaOH1 ml、蒸餾水100 ml、15.0 %福爾馬林2 ml；B液，AgNO32 g、蒸餾水100 ml）。</p><p>　　芽孢染色試驗：又稱Schaeffer-Fulton氏染色法，選取實驗需鑒定的菌種進(jìn)行常規(guī)涂片、干燥、固定操作。用滴管滴加數(shù)滴孔雀綠染液到涂

41、片上，之后用木夾子夾住載玻片一端放在微火上加熱，當(dāng)染料開始冒蒸氣時開始計時，維持這個狀態(tài)5 min；等玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗脫色，直至流出的水呈無色；最后用番紅染液對其進(jìn)行復(fù)染，染色2 min后用緩流水沖洗并吸干水分；在顯微鏡油鏡下觀察菌種，芽孢最終呈綠色，芽孢囊及營養(yǎng)體最終呈紅色。</p><p>　　菌體運(yùn)動性試驗：也叫壓滴法，在潔凈的載玻片上滴加一滴無菌水，將接種環(huán)于酒精燈上烘烤滅菌后挑取一環(huán)菌液與無

42、菌水混合，再加一環(huán)0.01 %的美藍(lán)水溶液并與菌液均勻混合。再取一干凈的蓋玻片，先將其一邊與菌液邊緣接觸，然后將蓋玻片輕輕的慢放下覆蓋在菌液上面；最后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察是將光圈調(diào)小使光線偏暗，此時觀察效果較好。有鞭毛的細(xì)菌會做直線式、波浪式或翻滾式運(yùn)動，當(dāng)兩個細(xì)菌之間出相明顯的位移并且能明顯的區(qū)別于布朗運(yùn)動或隨水的流動時，就可認(rèn)為是菌體的運(yùn)動。</p><p>　　過氧化氫酶試驗：取一潔凈的載玻片，在上面滴

43、加一滴3.0 %～5.0 %的過氧化氫溶液，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌齡為18 h～24 h的菌苔，涂抹于過氧化氫溶液中，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)則可判斷為過氧化氫酶陽性反應(yīng)，無氣泡則為過氧化氫酶陰性反應(yīng)。另外也可將過氧化氫直接加到菌種斜面上，直接觀察氣泡的產(chǎn)生做相應(yīng)的判斷。</p><p>　　氧化酶試驗：取一潔凈的培養(yǎng)皿，在內(nèi)里放置一張小濾紙片，在滴上1.0 %的鹽酸對氨基二甲苯氨液濕潤濾紙后，滴加等量的1.0 %α－萘

44、酚酒精溶液，同樣僅使濾紙濕潤即可，切忌過濕。再用白金絲接種環(huán)挑取菌齡為18 h～24 h的菌苔，涂抹在浸濕的濾紙上，觀察在10 s內(nèi)，菌苔呈現(xiàn)藍(lán)色則為陽性，否則為陰性。</p><p>　　葡萄糖氧化發(fā)酵試驗：將18 h～24 h的幼齡菌種穿刺接種于含有葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中，取一不接種的閉管作對照，每株菌種接種于4支試管中，其中2支用油封口以隔絕空氣作為閉管；另外2支不封口作為開管。在合適溫度下分別培養(yǎng)1

45、、2、4、7天后觀察結(jié)果并記錄。氧化型產(chǎn)酸者僅在開管中產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（1 d～2 d），后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸者開管閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。</p><p>　　分子生物學(xué)鑒定：16SRNA測序分析鑒定。</p><p>　　1.4.1.3 優(yōu)勢菌的培養(yǎng)</p><p>　　將分離純化后的優(yōu)勢菌接種到營養(yǎng)肉湯中，在30℃搖床

46、中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的培養(yǎng)物（即16h-20h的培養(yǎng)物），適當(dāng)稀釋后接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行抑菌實驗。</p><p>　　1.4.2 抑菌劑最小抑菌濃度測定</p><p>　　1.4.2.1 Shewanella sp.ANA-3菌懸液的制備</p><p>　　將分離純化后的優(yōu)勢菌接種到營養(yǎng)肉湯中，在30℃搖床中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的培養(yǎng)物（即16-18h的培養(yǎng)物

47、），適當(dāng)稀釋后接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行抑菌實驗。</p><p>　　1.4.2.2 最低抑菌濃度( MIC )的測定</p><p>　　將A、B、C、D、山梨酸鉀、氯化鈉等配置成不同濃度溶液，各取 2ml不同濃度的抑菌劑溶液分別與14ml無菌且冷卻到50℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，待凝固后，每個培養(yǎng)皿中加入 0.2 mL菌懸液涂布均勻，每個濃度做 3組平行，30℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，以

48、不長菌的最低濃度為最小抑制濃度 ( MIC )。其中取不加抑菌劑的無菌水作為空白對照。具體濃度見表1 。</p><p>　　表1 抑菌劑實驗濃度</p><p>　　Table 1 Experimental concentration of antibacterial agents顯示對應(yīng)的拉丁字符的拼音 字典</p><p>　　1.4.3 抑菌劑

49、交互作用及最佳抑菌組合方案</p><p>　　1.4.3.1 抑菌實驗</p><p>　　牛津杯法又稱管碟法。在超凈工作室內(nèi)完成平板的準(zhǔn)備，每個培養(yǎng)皿中加15ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，用移液槍取0.2ml Shewanella sp.ANA-3菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，靜置30min后每個平板各中放入3個牛津杯，在每個牛津杯中加入抑菌劑混合液0.2ml，實驗進(jìn)行兩組，標(biāo)準(zhǔn)a和

50、b，將操作完畢的A組培養(yǎng)皿放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h；B組放置在4℃冰箱中24h待其充分?jǐn)U散后放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑大小，并計算平均值，進(jìn)行對比研究。</p><p>　　1.4.3.2 正交實驗設(shè)計</p><p>　　在前實驗基礎(chǔ)上，選用A、B、C、D進(jìn)行正交實驗，考察0和1MIC指標(biāo)下，不同抑菌劑之間的交互作用，并確定最佳抑

51、菌劑組合方案。按照L16(215)進(jìn)行實驗，因數(shù)水平表見表2。</p><p>　　表2 正交實驗因素水平表</p><p>　　Table2 Orthogonal test factor level table</p><p><b>　　2 結(jié)果與討論</b></p><p><b>　　2.1 優(yōu)勢菌鑒

52、定</b></p><p>　　本實驗通過分離純化，得到槍烏賊優(yōu)勢腐敗菌群，并對其做分子生物學(xué)鑒定，確定其菌屬。經(jīng)測序結(jié)果經(jīng)序列同源性分析，知分離得到的優(yōu)勢菌分別為Shewanella sp.ANA-3、Shewanella sp.MR-4、Shewanella sp.TS29與Shewanella putrefaciens，基因相似度分別達(dá)到99.1%、95.8%、98.7%和97.8%，與生理生化

53、實驗結(jié)果吻合。其中，不同環(huán)境溫度下，希瓦氏菌中的Shewanella sp.ANA-3所占比分別達(dá)到60.13% 、65.34%、67.27%、70.79%、72.08%、76.61%，故可認(rèn)為Shewanella sp.ANA-3為優(yōu)勢腐敗菌，其測序結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　TGCAGTCGAGCGGCAGCACAAGGGAGTTTACTCCTGAGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTA

54、ATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGTGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTCCGCGATTGGATGAACCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC

55、TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGTTATAAGTTAATACCTTGCAGCTGTGACGTTACCTACAGAAGAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTCCAAGCGTTAATC<

56、;/p><p>　　圖3 菌株基因序列圖</p><p>　　Fig.3 The gene sequence of strain</p><p>　　2.2 抑菌劑最小抑菌濃度（MIC）</p><p>　　分析表3知，實驗選取的8種抑菌劑中共有6種在實驗濃度條件下對Shewanella sp.ANA-3產(chǎn)生了有效的抑菌作用，山梨酸鉀和二氧化氯達(dá)

57、到GB2760的最大使用濃度仍無顯著效果。其中食鹽因為濃度過高，考慮到實際加工生產(chǎn)中使用限制過大予以舍棄，而SH-3防腐劑即羥甲基甘氨酸鈉雖具有較好殺菌效果但因其毒性較大，故從安全性角度考慮，也予以舍棄。故最終決定選取A、B、C、D進(jìn)行進(jìn)一步分析研究，其中A、B、C和D進(jìn)最小抑菌濃度分別為1mg/ml 、0.8mg/ml、 160μg/ml、1.25μg/ml。</p><p>　　表3 各抑菌劑的MIC值 &l

58、t;/p><p>　　Table 3 The MIC values ??of antimicrobial agents</p><p>　　2.3 抑菌劑交互作用及組合方案</p><p>　　2.3.1 實驗方法確定</p><p>　　平板預(yù)先擴(kuò)散處理的影響，實驗證明經(jīng)冰箱擴(kuò)散后比不擴(kuò)散效果明顯，可能原因有：⑴抑菌劑充分?jǐn)U散；⑵冰箱的低溫一定

59、程度上抑制了細(xì)菌的生長，對滅菌有正向協(xié)同作用。</p><p>　　此外，實驗中還發(fā)現(xiàn)Shewanella sp.ANA-3菌懸液濃度對牛津杯法實驗結(jié)果有一定影響:菌懸液濃度過高則抑菌效果不明顯；過稀則菌體生長稀疏，抑菌圈邊緣不清晰，難以準(zhǔn)確測量。經(jīng)實驗得出當(dāng)菌懸液濃度控制在105-106cfu/ml時，抑菌圈實驗效果較好，故采用培養(yǎng)16-18h的菌懸液以10倍遞增稀釋三次進(jìn)行抑菌實驗。</p>&

60、lt;p>　　2.3.2 正交實驗分析</p><p>　　本實驗以四種不同滅菌劑對Shewanella sp.ANA-3菌生長抑制最大化的組合為研究方向，運(yùn)用正交實驗的方法，結(jié)合牛津杯法建立抑菌區(qū)，對滅菌劑的組合方案進(jìn)行了研究分析。實驗結(jié)果見表4，方差分析見表5，從實驗結(jié)果可知四種不同滅菌中，A、B、C以及B和D的交互作用對Shewanella sp.ANA-3菌的抑制生長存在非常顯著的影響（P<0

61、.01）；A和B的交互作用對Shewanella sp.ANA-3菌的抑制生長存在顯著的影響(P<0.05)。各因素對Shewanella sp.ANA-3菌的影響程度為B>C>A>D，得出最佳抑菌作用組合：A為1mg/ml,B為0.8mg/ml C為160μg/ml D為0μg/ml </p><p><b>　　表4 正交實驗結(jié)果</b></p>&

62、lt;p>　　Table 4 the results of orthogonal experiments</p><p><b>　　表5 方差分析結(jié)果</b></p><p>　　Table 5 Analysis of variance</p><p><b>　　3 驗證實驗</b></p><

63、;p>　　按正交實驗得出的最佳組合方案配置滅菌劑混合液，用牛津杯法測量抑菌圈直徑，對比先前的實驗數(shù)據(jù)，得出其抑菌圈直徑為27.23mm比前面所有的測量數(shù)據(jù)都大，表明優(yōu)化結(jié)果能更好地抑制腐敗菌的生長與繁殖。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　4.1 實驗采用的凍藏槍烏賊腐敗時微生物種類較多，經(jīng)提取、分離純化等手段，并作分子生物學(xué)鑒定

64、得到其優(yōu)勢腐敗菌為Shewanella sp.ANA-3。</p><p>　　4.2 以Shewanella sp.ANA-3菌為目標(biāo)選用合適滅菌劑進(jìn)行抑菌活力研究。研究結(jié)果表明，山梨酸鉀和二氧化氯在實驗濃度下對Shewanella sp.ANA-3無抑制作用，羥甲基甘氨酸鈉與氯化鈉在有效抑菌濃度下缺乏實際應(yīng)用價值也予以舍棄，故最終選用抑菌劑A、B、C、D進(jìn)行進(jìn)一步研究，且它們的最小抑菌濃度（MIC）分別為1m

65、g/ml、0.8mg/ml、 160μg/ml、 1.25μg/ml。</p><p>　　4.3 研究利用正交實驗，通過比較抑菌圈的大小，來確定最佳抑菌劑組合方案。結(jié)果表明：在A為1mg/ml,B為0.8mg/ml，C為0.16mg/ml時數(shù)據(jù)模型顯示具有最佳的抑菌能力，在此條件下Shewanella sp.ANA-3菌的生長受到了較大的抑制。后經(jīng)驗證實驗得出這一組合下的抑菌圈直徑大小為27.23mm，大于所有

66、的組合方案，與正交試驗直觀分析結(jié)果一致。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 王杏珠.日本水產(chǎn)品保鮮技術(shù)的現(xiàn)狀及研究概況[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,1997,12(8):16-19.</p><p>　　[2] 陸忠康.國外水產(chǎn)品的保鮮加工及綜合利用[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,1985(3):33-37.</p&g

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