桃軟腐菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)麥角固醇工藝研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：桃軟腐菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)麥角固醇工藝研究</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) &l

2、t;/p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信承諾書(shū)</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)），是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下嚴(yán)格按照學(xué)校和學(xué)院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人的觀點(diǎn)和參考

3、資料均加以注釋和說(shuō)明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）沒(méi)有抄襲他人研究（設(shè)計(jì)）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）若有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。</p><p>　　學(xué)生簽名： </p><p>　　日 期：

4、 </p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本文以桃軟腐菌為生物菌種，采用HPLC法檢測(cè)麥角固醇含量為指標(biāo)，在液態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)曲面（RSM）法設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)麥角固醇的工藝參數(shù)。根據(jù)響應(yīng)曲面法分析建立液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)麥角固醇模型：</p><p>　　Y=-1406.14602+437.64936A+221.

5、14555B+257.94438C+82.48691D+50.26850AB-42.63725AC-21.38442AD-13.76908BC+11.30408BD+1.08376CD-53.84375A2-36.24275B2-5.51385C2-4.99058D2 </p><p>　　最佳優(yōu)化工藝條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蔗糖2.00g/100mL，pH值5.00，接種量8%和發(fā)酵天數(shù)10.52d。此條件下10

6、0mL液體發(fā)酵培養(yǎng)菌體生物量211.000mg，平均產(chǎn)麥角固醇量906.223µg，與構(gòu)建模型的理論預(yù)測(cè)值985.149μg非常接近，麥角固醇含量4294.896µg/g，菌體生物量與麥角固醇產(chǎn)量不相關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明桃軟腐菌為高產(chǎn)麥角固醇菌株，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。</p><p>　　關(guān)鍵詞：桃軟腐菌；麥角固醇；響應(yīng)面分析</p><p><b>　　ABSTRACT&

7、lt;/b></p><p>　　In this paper, Rhizopus (Rhizopus sp) as biological species, ergosterol content detected by HPLC as indicator, on the basis that single-factor test in the liquid fermentation, application

8、of response surface method (RSM) design optimize the process parameters for production of ergosterol. Based on response surface methodology analyse the model of liquid fermentation produse ergosterol: Y=-1406.14602+437

9、.64936A+221.14555B+257.94438C+82.48691D+50.26850AB-42.63725AC-21.38442AD-13.76908BC+11.30408</p><p>　　Optimum conditions: PDA based medium supplemented with Sucrose 2.00g/100mL, PH value 5.00, inoculation am

10、ount 8% and fermentation time 10.52d. Under the conditions, 100ml liquid fermentation culture of bacterial biomass211.000mg, the production of ergosterol was an average of 906.223µg, very close to the theoretical pr

11、ediction 985.149μg, ergosterol content 4294.896µg/g, bacterial biomass and ergosterol production are not correlative. Experiment suggested that the Rhizopus (Rhizopus sp) strains f</p><p>　　Key words: R

12、hizopus; ergosterol; response surface analysis</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 理化性質(zhì)1</p><p>　　1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1</p>

13、<p>　　1.3 麥角固醇的應(yīng)用及市場(chǎng)前景1</p><p>　　1.4 本文研究?jī)?nèi)容與意義2</p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><p><b>　　2.1 材料2</b></p><p>　　2.1.1 發(fā)酵菌種2</p><

14、p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑2</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備3</p><p><b>　　2.2 方法3</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基配制3</p><p>　　2.2.2 桃軟腐菌菌種活化4</p><p>　　2.2.3 菌種孢子懸液制備4&l

15、t;/p><p>　　2.2.4 桃軟腐菌液體發(fā)酵單因素試驗(yàn)4</p><p>　　2.2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝設(shè)計(jì)5</p><p>　　2.2.6 菌體生物量測(cè)定5</p><p>　　2.2.7 麥角固醇含量檢測(cè)方法6</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析7</b></p

16、><p>　　3.1 孢子懸液平板計(jì)數(shù)結(jié)果7</p><p>　　3.2 麥角固醇（HPLC）標(biāo)準(zhǔn)曲線7</p><p>　　3.3 添加不同碳源對(duì)麥角固醇總量的影響8</p><p>　　3.4 不同蔗糖濃度對(duì)麥角固醇總量的影響8</p><p>　　3.5 添加不同氮源對(duì)麥角固醇總量的影響9</p>

17、;<p>　　3.6 不同硫酸銨濃度對(duì)麥角固醇總量的影響9</p><p>　　3.7 不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量的影響10</p><p>　　3.8 不同的pH值對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量的影響11</p><p>　　3.9 不同的接種量對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量的影響11</p><p>　　3.10 響

18、應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果11</p><p>　　3.10.1 麥角固醇總量結(jié)果與分析12</p><p>　　3.10.2 生物量結(jié)果與分析14</p><p>　　3.10.3 生物量與麥角固醇總量的相關(guān)性17</p><p>　　3.11 優(yōu)化工藝條件確定及其驗(yàn)證17</p><p><b>　　4

19、 結(jié)論18</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)20</b></p><p><b>　　致 謝21</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1 理化性質(zhì)</b></p>

20、<p>　　麥角固醇(Ergosterol)又名麥角甾醇，化學(xué)名稱為24β-甲基膽固醇-5，7烯-3β-羥基，分子量為396.66。常溫下是固體，熔點(diǎn)為156℃~158℃，23℃時(shí)旋光度為127.5（C=1.2,氯仿），不溶于水，易溶于乙醚、石油醚、乙醇、甲醇、正庚烷等有機(jī)溶劑。</p><p>　　麥角固醇屬于不飽和化合物，當(dāng)遇到空氣中的氧或光線時(shí)即使在常溫下也能被氧化。紫外照射波長(zhǎng)的不同會(huì)對(duì)麥角

21、固醇光轉(zhuǎn)化產(chǎn)生較大的影響。過(guò)度照射時(shí)還可生成超甾醇等物質(zhì)[1]。</p><p>　　1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀</p><p>　　目前，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)麥角固醇的方法主要有兩種，一是采用酵母發(fā)酵法，即通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)麥角固醇的酵母而得到，另一種是從抗生素菌絲體中提取麥角固醇。</p><p>　　酵母發(fā)酵法生產(chǎn)麥角固醇主要所發(fā)酵的菌種有酵母菌、曲霉菌、青霉菌等。其產(chǎn)量分別可達(dá)

22、到細(xì)胞干重的2.7%、2.0%和1.8%左右[2-3]。發(fā)酵法生產(chǎn)的麥角固醇含量高，但由于國(guó)內(nèi)工藝落后，產(chǎn)品生產(chǎn)成本較高，與國(guó)外相比還存在較大的差距。從抗生素菌絲體中提取麥角固醇主要以青霉菌、檸檬或乳酸發(fā)酵廢菌絲體為原料。其工藝流程為：細(xì)胞破壁、皂化、萃取，然后將萃取液濃縮、結(jié)晶得麥角固醇，所得麥角固醇純度95%以上。提取法生產(chǎn)技術(shù)的原料來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化[4]。</p><p>　　1

23、.3 麥角固醇的應(yīng)用及市場(chǎng)前景</p><p>　　麥角固醇可用于“可的松”、“激素黃體酮”以及“蕓苔素內(nèi)酯”等藥物的生產(chǎn)，是一種重要的醫(yī)藥和農(nóng)藥原料[5]。麥角固醇還可以用于表征真菌生物量，它作為真菌細(xì)胞膜的重要組成物質(zhì)，具有很強(qiáng)的專一性，為表征真菌生物量提供了可能[6,7]。麥角固醇還是維生素D2的前體。維生素D2是一種重要的藥品, 它在調(diào)節(jié)生命代謝功能上有非常重要的作用，可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣、磷的吸收和儲(chǔ)存，以

24、提高血鈣和血磷的含量。</p><p>　　我國(guó)人口眾多，老年人的骨質(zhì)疏松癥和兒童的佝僂病的發(fā)病率很高。老年骨質(zhì)疏松癥患者達(dá)6000多萬(wàn)人，占老年人口總數(shù)的60%。據(jù)美國(guó)RDA推薦，成年人攝入10μg/天維生素D2，可明顯降低老年患骨質(zhì)疏松病的危險(xiǎn)；兒童食用維生素D2 100μg /d，可防止軟骨病和佝僂病的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)每年食用、藥用維生素D2年需求量可達(dá)100t，若再加上飼料業(yè)對(duì)維生素D2的需求，我國(guó)維生素

25、D2的年需求量可達(dá)200t，若全部用麥角固醇生產(chǎn)，則年需用麥角固醇量約600t，這將是一個(gè)巨大的潛在市場(chǎng)[8]。</p><p>　　1.4 本文研究?jī)?nèi)容與意義</p><p>　　目前，我國(guó)維生素D2行業(yè)由于菌種發(fā)酵水平低，提取工藝落后，使維生素D2不得不依賴進(jìn)口。我國(guó)每年進(jìn)口的維生素D2近7噸，花費(fèi)外匯3500萬(wàn)美元，進(jìn)口的維生素D2只用于人用維生素D2范圍，而飼料用維生素D2尙是空白

26、。因此，本文擬選用實(shí)驗(yàn)室保藏的桃軟腐菌進(jìn)行產(chǎn)麥角固醇的液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以期為工業(yè)化生產(chǎn)麥角固醇提供高產(chǎn)菌株及生產(chǎn)工藝奠定理論基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2 材料與方法 </b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p><p>　　2.1.1 發(fā)酵菌種</p><p>

27、　　實(shí)驗(yàn)用桃軟腐菌ZW007（Penicillium），由浙江萬(wàn)里學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑</p><p>　　表1 實(shí)驗(yàn)主要試劑一覽表</p><p><b>　　續(xù)表1</b></p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備</p><p>　　表2 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)

28、備一覽表</p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基配制</p><p>　　2.2.1.1 活化培養(yǎng)基</p><p>　　采用PDA為活化培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基11.5g，加入蒸餾水250mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，移至500mL錐形瓶后于12

29、1℃高壓滅菌20min，待冷卻至50-60℃分裝平板培養(yǎng)基，待用。</p><p>　　2.2.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基</p><p>　　蔗糖3%、硝酸鈉0.2%、硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸亞鐵0.0001%</p><p>　　2.2.2 桃軟腐菌菌種活化</p><p>　　將斜面保藏的桃軟腐菌用接種環(huán)接種

30、到PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7d。</p><p>　　2.2.3 菌種孢子懸液制備</p><p>　　按照配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min，待冷卻后，將在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌種用涂布棒把真菌孢子刮下，收集菌體制成懸液，測(cè)定懸液菌落總數(shù)。以2%的接種量接入三角瓶中，28℃振蕩（150r/min）搖瓶培養(yǎng)3~4d。</p><p>

31、　　2.2.4 桃軟腐菌液體發(fā)酵單因素試驗(yàn)</p><p>　　2.2.4.1 碳源的篩選及添加量試驗(yàn)</p><p>　　分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加3g/100mL含量的葡萄糖、蔗糖、乳糖為碳源，其它的試劑不變。活化發(fā)酵培養(yǎng)3~4d，平行試驗(yàn)2次，檢測(cè)菌體中產(chǎn)麥解固醇量。將篩選出產(chǎn)最高麥角固醇碳源，分別以1g/100mL、2g/100mL、3g/100mL、4g/100mL、5g/100mL

32、的不同濃度加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行最適添加量試驗(yàn)，平行2次，通過(guò)高效液相色譜分析得出最適濃度的碳源及其產(chǎn)麥角固醇的總量。</p><p>　　2.2.4.2 氮源的篩選及添加量試驗(yàn)</p><p>　　將牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、酵母膏分別以0.2g/100mL的濃度加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)，活化發(fā)酵培養(yǎng)3d，平行試驗(yàn)2次，檢測(cè)菌體中產(chǎn)麥角固醇量。將篩選出產(chǎn)最高麥角固醇氮源，分別以0.1g

33、/100mL、0.2g/100mL、0.3g/100mL、0.4g/100mL、0.5g/100mL的不同濃度加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行最適添加量試驗(yàn)，平行2次，通過(guò)高效液相色譜分析得出最適濃度的氮源及其產(chǎn)麥角固醇的總量。</p><p>　　2.2.4.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種產(chǎn)麥角固醇試驗(yàn)</p><p>　　100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入最佳碳源和氮源，以2%的接種量在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃分別培

34、養(yǎng)2d、4d、6d、8d、10d、12d，每個(gè)時(shí)間設(shè)2個(gè)平行試驗(yàn)，用電子天平測(cè)出生物量，高效液相測(cè)出產(chǎn)麥角固醇量，取平均值。</p><p>　　2.2.4.4 不同的接種量對(duì)菌種產(chǎn)麥角固醇試驗(yàn)</p><p>　　在培養(yǎng)瓶中分別裝入基本培養(yǎng)基98mL、96mL、94mL、92mL，將液體種子按接種量2mL、4mL、6mL、8mL分別接入基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度為37℃，

35、轉(zhuǎn)速為120r/min進(jìn)行液體發(fā)酵，培養(yǎng)時(shí)間為3d，設(shè)置2個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)出生物量及麥角固醇的總量，取平均值。</p><p>　　2.2.4.5 不同的pH對(duì)菌種產(chǎn)麥角固醇試驗(yàn)</p><p>　　用最佳的碳源和氮源按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配比配置培養(yǎng)基，加入2%的接種量，用NaOH溶液和HCl溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH值至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為3

36、7℃，轉(zhuǎn)速為120r/min，培養(yǎng)時(shí)間為3d，設(shè)置2個(gè)平行試驗(yàn)，得出生物量和麥角固醇的總量，取平均值。</p><p>　　2.2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝設(shè)計(jì)</p><p>　　為了在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上尋找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以菌體采用響應(yīng)面分析方法研究幾個(gè)發(fā)酵條件因素間交互作用對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇含量的影響，以確定最佳提取工藝參數(shù)[9]。按照實(shí)驗(yàn)

37、工藝流程分別對(duì)菌體發(fā)酵的不同條件，即碳源的濃度，氮源的濃度，發(fā)酵天數(shù)，pH值和接種量，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件，再借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert（version7.1.3），采用響應(yīng)面法的中心組合設(shè)計(jì)（Central Com-posite Design，CCD）考察幾個(gè)因素間交互作用對(duì)發(fā)酵菌體中麥角固醇含量的影響，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上尋找到發(fā)酵過(guò)程中整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組

38、合和響應(yīng)值的最優(yōu)值以確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下表3所示。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)所得到最佳液體發(fā)酵條件進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三次，并對(duì)發(fā)酵菌體進(jìn)行麥角固醇提取，檢測(cè)每100mL液體培養(yǎng)基中麥角固醇總量。</p><p>　　表3 桃軟腐菌液體發(fā)酵響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)優(yōu)化水平表</p><p>　　2.2.6 菌體生物量測(cè)定</p><p>　　將培養(yǎng)瓶中菌體發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至5

39、0mL離心管中，10000rpm，離心10min，棄上清液，蒸餾水洗滌沉淀2次，重復(fù)離心，所得菌體于真空干燥箱50-60℃下烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取的質(zhì)量為生物量。</p><p>　　2.2.7 麥角固醇含量檢測(cè)方法</p><p>　　2.2.7.1 麥角固醇的樣品制備</p><p>　　麥角固醇提取參考文獻(xiàn)[10]方法，采用皂化—萃取方法測(cè)定麥角固醇。</

40、p><p>　　樣品的皂化：將上述烘干菌體和20g左右的氫氧化鉀，加入到圓底燒瓶中，再加入40mL無(wú)水乙醇和60mL蒸餾水，充分混勻，置于90℃水浴中回流2.5h，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。</p><p>　　乙醚萃?。合蚍忠郝┒分屑尤?0mL左右的乙醚，劇烈震蕩，靜置一段時(shí)間后，會(huì)產(chǎn)生分層，取上層的乙醚相，并將下層水相再重復(fù)萃取一次。用去離子水洗至中性。</p><

41、p>　　乙醇定容：將乙醚相放入70℃的水浴鍋中蒸發(fā)濃縮至干，用無(wú)水乙醇溶解定容至5mL，用無(wú)菌注射器和0.45μm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，將濾液注入2mL eppendorf 管中，此為麥角固醇樣品溶液，低溫保存。</p><p>　　2.2.7.2 高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)麥角固醇</p><p>　　根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]改進(jìn)采用HPLC法檢測(cè)麥角固醇含量。</p>

42、<p>　　色譜條件：色譜柱為4.6150mm，直徑為5μm的ODSC-18 柱，流動(dòng)相為甲醇/水（V/V=97:3），流速為1.200mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)282nm，進(jìn)樣量20μL，進(jìn)樣時(shí)間15min。</p><p>　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取麥角固醇（Ergosterol） 標(biāo)準(zhǔn)品0.1g(精確0. 0001g) ，用無(wú)水乙醇定容至50mL 容量瓶，其濃度為2mg/mL，作標(biāo)準(zhǔn)貯備液

43、。再用標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別配制成10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，75μg/mL ，100μg/mL五份標(biāo)準(zhǔn)液，0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，按上述的色譜條件在Agilent1100儀器上進(jìn)行檢測(cè)分析。以麥角固醇濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　樣品測(cè)定：將2.2.7.1中制備好的樣品溶液，在上述色譜條件下，Agilent1100上機(jī)檢測(cè)，分析產(chǎn)品中麥角固醇的含量。計(jì)算峰面積

44、與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得出所測(cè)100mL發(fā)酵培養(yǎng)溶液中麥角固醇的總量及菌體中產(chǎn)麥角固醇含量。麥角固醇提取率計(jì)算公式：</p><p>　　100mL液體培養(yǎng)基中麥角固醇總量：N×5</p><p>　　菌體中產(chǎn)麥角固醇含量：W＝（N×5）/M</p><p>　　式中：W——每克菌體產(chǎn)麥角固醇量；</p><p>　　N——樣品

45、中麥角固醇濃度（g/mL）；</p><p><b>　　M——菌體生物量。</b></p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 孢子懸液平板計(jì)數(shù)結(jié)果</p><p>　　將桃軟腐菌菌種懸液分別以10-8、10-7、10-6、10-5倍稀釋后，轉(zhuǎn)接到各PDA固體平

46、板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，待長(zhǎng)出均勻菌落后準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。其結(jié)果如下：</p><p>　　表4 桃軟腐菌菌落計(jì)數(shù)</p><p>　　由表4可以得出，桃軟腐菌懸液含菌量達(dá)到了1×107個(gè)/ mL，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以桃軟腐菌菌種懸液1×107個(gè)/ mL菌液量接種。</p><p>　　3.2 麥角固醇（HPLC）標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p

47、>　　配制不同濃度的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，Agilent1100液相色譜儀，在282nm下分析測(cè)定得色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1表明此色譜工作條件下色譜峰分離效果較好，儀器性能良好，誤差較低。麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程：y=22377x-34849，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9995。方程表明，麥角固醇在10～100μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可以用來(lái)檢測(cè)樣品中的麥角固醇含量。</p><p>　　圖1

48、麥角固醇標(biāo)樣及樣品分離色譜圖</p><p>　　圖2 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖</p><p>　　3.3 添加不同碳源對(duì)麥角固醇總量的影響</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用了蔗糖、葡萄糖、乳糖作為培養(yǎng)基碳源，考察了桃軟腐菌的生物量、麥角固醇總量變化，結(jié)果見(jiàn)圖3所示，當(dāng)添加蔗糖作為補(bǔ)充碳源時(shí)，麥角固醇總量最高，菌體含885.135μg/100mL的麥角固醇。因此，后續(xù)選

49、擇蔗糖為最佳添加碳源進(jìn)行試驗(yàn)。</p><p>　　圖3 不同碳源對(duì)菌體生物量及麥角固醇總量的影響</p><p>　　3.4 不同蔗糖濃度對(duì)麥角固醇總量的影響</p><p>　　基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加不同蔗糖濃度進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如圖4所示，隨蔗糖濃度升高，菌體干細(xì)胞中麥角固醇的總量逐漸升高。當(dāng)蔗糖濃度為2.00g/100mL時(shí)，菌體中所含的麥角固醇總量接近最大

50、值983.806μg/100mL，之后有降低趨勢(shì)，表明麥角固醇在菌體中富集到一定程度，可能對(duì)所產(chǎn)生合成過(guò)程中HMG-CoA還原酶的作用受到抑制[12]有關(guān)，同時(shí)菌體中蔗糖分解代謝相關(guān)的酶趨于飽和不再結(jié)合底物有關(guān)。從圖中可以看出生物量與菌株產(chǎn)麥角固醇總量不成比例關(guān)系。</p><p>　　圖4 不同蔗糖濃度對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量及生物量的影響</p><p>　　3.5 添加不同氮源對(duì)麥

51、角固醇總量的影響</p><p>　　如圖5所示，添加不同氮源對(duì)菌體中產(chǎn)生麥角固醇的總量影響也較為明顯[13]。在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)中添加4種不同的氮源，經(jīng)測(cè)定硫酸銨最有利于菌體產(chǎn)麥角固醇，其總量可達(dá)1149.610μg/100mL。因此，基礎(chǔ)培養(yǎng)中添加硫酸銨為最佳氮源。在圖5中，生物量和麥角固醇總量不存在相關(guān)性。</p><p>　　圖5 不同氮源對(duì)菌體生物量及麥角固醇總量的影響</p

52、><p>　　3.6 不同硫酸銨濃度對(duì)麥角固醇總量的影響</p><p>　　培養(yǎng)基中氮源過(guò)多，會(huì)引起微生物生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，而不利于產(chǎn)物的積累；氮源不足，則微生物菌體生長(zhǎng)過(guò)于緩慢。液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的硫酸銨后，結(jié)果如圖6所示。隨著硫酸銨濃度的增加，菌體中麥角固醇的總量隨之增高。當(dāng)硫酸銨添加濃度至0.3g/100mL時(shí)，達(dá)到峰值（986.557μg/100mL）之后，麥角固醇的總量也隨之

53、降低?？赡芘c麥角固醇的產(chǎn)物抑制菌株產(chǎn)代謝物有關(guān)，表明適當(dāng)濃度的氮源添加有利于桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇。</p><p>　　圖6 不同硫酸銨濃度對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量及生物量的影響</p><p>　　3.7 不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量的影響</p><p>　　將菌種接入相同的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作不同的發(fā)酵時(shí)間的搖床培養(yǎng)，研究菌體的生長(zhǎng)規(guī)律及發(fā)酵時(shí)間對(duì)麥角固

54、醇合成的影響。如圖7，從接種后的第6.14d生物量達(dá)到最大值。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇的總量逐漸增高，當(dāng)天數(shù)為10d時(shí)麥角固醇總量達(dá)到最大值，隨后麥角固醇總量逐漸下降。說(shuō)明當(dāng)菌體產(chǎn)生一定的麥角固醇后，由于培養(yǎng)基中的條件改變，如氧氣、pH值、次級(jí)代謝產(chǎn)物等的抑制作用會(huì)使麥角固醇的合成受影響。</p><p>　　圖7 不同培養(yǎng)基發(fā)酵天數(shù)對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量及生物量的影響</p>&l

55、t;p>　　3.8 不同的pH值對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量的影響</p><p>　　研究培養(yǎng)基中不同pH值對(duì)生物量、麥角固醇總量的影響。菌體在試驗(yàn)的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，pH值對(duì)生物量影響不大，當(dāng)pH值為5.0時(shí)菌體產(chǎn)麥角固醇總量最多為880.156μg/100mL。生物量在pH為7.0時(shí)達(dá)到最大值292.000mg/100mL。分析表明生物量、麥角固醇總量?jī)烧咧g不存在正比關(guān)系。</p><

56、p>　　圖8 不同pH值對(duì)對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量及生物量的影響</p><p>　　3.9 不同的接種量對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量的影響</p><p>　　研究在培養(yǎng)基中不同接種量對(duì)生物量及麥角固醇總量（圖9）的影響。當(dāng)接種量為2%時(shí)，生物量達(dá)到最大值為222.000mg/100mL。當(dāng)接種量為8%時(shí)，菌體產(chǎn)麥角固醇總量達(dá)到最高峰977.851μg/100mL。說(shuō)明接種量過(guò)多過(guò)少

57、都會(huì)影響菌體產(chǎn)麥角固醇的量。</p><p>　　圖9 不同接種量對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇總量及生物量的影響</p><p>　　3.10 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果</p><p>　　3.10.1 麥角固醇總量結(jié)果與分析</p><p>　　采用響應(yīng)面分析方法研究幾個(gè)發(fā)酵條件因素間交互作用對(duì)桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇的影響，以確定最佳的液體發(fā)酵條件。以菌

58、體產(chǎn)麥角固醇總量為響應(yīng)值的模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。</p><p>　　從響應(yīng)面模型方差分析表6可知，模型的F值小于0.0500，表明該模型顯著，失擬值P=0.3760，表明由誤差引起的失擬不顯著。模型的確定系數(shù)值為0.7270，調(diào)整校正確定系數(shù)為0.4540，兩者具有一致性，說(shuō)明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系明顯；模型的變異系數(shù)值為8.10%，說(shuō)明模型的精密度較好。綜合以上各參數(shù)表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠，各因

59、素水平間設(shè)計(jì)合理，因此可用該回歸模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析?；貧w模型各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明AC影響為高度顯著項(xiàng)，其余均不顯著。利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果（表）進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到麥角固醇總量對(duì)自變量A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸方程： </p><p>　　Y=-1406.14602+437.64936A+221.14555B+257.94438C+82.48691D+

60、50.26850AB-42.63725AC-21.38442AD-13.76908BC+11.30408BD+1.08376CD-53.84375A2-36.24275 B2-5.51385C2-4.99058 D2 </p><p>　　表5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果</p><p><b>　　續(xù)表5</b></p>&

61、lt;p>　　表6 響應(yīng)面二次模型的方差分析</p><p><b>　　續(xù)表6</b></p><p>　　注：“Prob > F”﹤0.00100 極顯著，“Prob > F”﹤0.0100 高度顯著，“Prob > F” ﹤0.0500，顯著；“Prob > F”﹥0.100，不顯著[14]。</p><p&g

62、t;　　3.10.2 生物量結(jié)果與分析</p><p>　　從響應(yīng)面模型方差分析表8可知，模型的F值小于0.0500，表明該模型顯著，失擬值P=0.3442，表明由誤差引起的失擬不顯著。模型的確定系數(shù)值為0.7408，調(diào)整校正確定系數(shù)為0.4816，兩者具有一致性，說(shuō)明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系明顯；模型的變異系數(shù)值為13.10%，說(shuō)明模型的精密度較好。綜合以上各參數(shù)表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠，各因素水平間設(shè)計(jì)合

63、理，因此可用該回歸模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。回歸模型各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明A、AC、C2影響為顯著項(xiàng)，其余均不顯著。利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果（表）進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到生物量對(duì)自變量A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸方程：</p><p>　　Y=+569.96944-40.70000A+4.76667B-41.58333C-63.53889D-11.00000AB+9.333

64、33AC-6.00000AD-6.16667BC+6.08333BD+2.86111CD+15.70000A2+1.57500B2+2.56389C2+1.88333D2</p><p>　　表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果</p><p><b>　　續(xù)表7</b></p><p>　　表8 響應(yīng)面二次模型的方差分析<

65、/p><p>　　3.10.3 生物量與麥角固醇總量的相關(guān)性</p><p>　　圖10所示為響應(yīng)值的模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)生物量和麥角固醇總量的結(jié)果。由圖11可以看出生物量與麥角固醇總量之間沒(méi)有相關(guān)性。</p><p>　　圖10 生物量和麥角固醇總量的響應(yīng)值的模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　圖11 生物量與麥角固醇總量的相關(guān)性</p&g

66、t;<p>　　3.11 優(yōu)化工藝條件確定及其驗(yàn)證</p><p>　　根據(jù)二次回歸模型得到等高線圖(圖12)和三維響應(yīng)面圖（圖13），接種量與發(fā)酵天數(shù)兩個(gè)變量在圖中表示。從圖中表明在本試驗(yàn)設(shè)定的變量范圍內(nèi)，預(yù)測(cè)100mL液體培養(yǎng)基中菌體最高可產(chǎn)麥角固醇量為985.149μg/100mL。此時(shí)優(yōu)化各項(xiàng)自變量分別為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蔗糖濃度2.00g/100mL，pH值5.00，接種量8%和發(fā)酵天數(shù)10

67、.52d。依此條件下進(jìn)行桃軟腐菌液體發(fā)酵培養(yǎng)，重復(fù)三次試驗(yàn)，得到100mL菌體中麥角固醇平均量為906.223µg/100mL，與模型預(yù)測(cè)值非常接近，充分反映曲面模型有效及具有強(qiáng)大的分析能力，可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。</p><p>　　圖12 接種量和發(fā)酵天數(shù)對(duì)麥角固醇提取的影響等高線圖</p><p>　　圖13 接種量和發(fā)酵天數(shù)對(duì)麥角固醇提取的影響三維響應(yīng)面圖<

68、;/p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　通過(guò)單因素法與響應(yīng)面法相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法較快速、有效地從眾多影響桃軟腐菌液體培養(yǎng)產(chǎn)麥角固醇的因素中篩選出主要的影響因素，并實(shí)現(xiàn)發(fā)酵條件優(yōu)化組合，建立了桃軟腐菌液體發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇的多元二次回歸方程：</p><p>　　Y=-1406.14602+437.64936A+221.14555

69、B+257.94438C+82.48691D+50.26850AB-42.63725AC-21.38442AD-13.76908BC+11.30408BD+1.08376CD-53.84375A2-36.24275 B2-5.51385C2-4.99058 D2 </p><p>　　運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化桃軟腐菌液體發(fā)酵產(chǎn)麥角固醇工藝，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桃軟腐菌生產(chǎn)麥角固醇的最優(yōu)化條件為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2.00g/1

70、00mL蔗糖，pH值5.00，接種量8%和發(fā)酵天數(shù)10.52d，此條件下100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)菌體生物量211.000mg，平均產(chǎn)麥角固醇量906.223µg，與構(gòu)建模型的理論預(yù)測(cè)值985.149μg非常接近，麥角固醇含量4294.896μg/g。說(shuō)明響應(yīng)面模型可很好地應(yīng)用于桃軟腐菌產(chǎn)麥角固醇的工藝條件優(yōu)化。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p>&l

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78、的選題、實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)到論文的完稿，導(dǎo)師們傾注了大量的心血。導(dǎo)師們淵博的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的治學(xué)態(tài)度及敬業(yè)精神，給我留下了深刻的印象，并將在我今后的人生道路上產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，在此論文完成之際，謹(jǐn)向兩位導(dǎo)師致以崇高的敬意和衷心的感謝！</p><p>　　此外，還要感謝在學(xué)習(xí)、生活和工作中幫助和鼓勵(lì)過(guò)我的同學(xué)、學(xué)姐和學(xué)長(zhǎng)們，正因?yàn)橛心銈兊闹С植庞形医裉斓某晒?。我衷心的謝謝你們。</p><p>