海魚(yú)異尖線蟲(chóng)分子檢測(cè)和鑒定技術(shù)的研究.pdf

1、異尖線蟲(chóng)是世界各大海域魚(yú)類普遍寄生的寄生蟲(chóng)。人誤食寄生在海魚(yú)體內(nèi)的異尖線蟲(chóng)科某些種的活的Ⅲ期幼蟲(chóng)可引起異尖線蟲(chóng)病(Anisakiasis)。到目前為止已報(bào)道可引起人異尖線蟲(chóng)病的主要有6種異尖線蟲(chóng),即簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)(Anisakissimplex)、典型異尖線蟲(chóng)(A.typica)、抹香鯨異尖線蟲(chóng)(A.physeteris)、擬地新線蟲(chóng)(Psetwloterranova decipiens)、對(duì)盲囊線蟲(chóng)(Contracaccum spp.)

2、和宮脂線蟲(chóng)(Hystesterothylacium spp.)。由于異尖線蟲(chóng)足海洋自然疫源性病原,隨著鮮食魚(yú)生的國(guó)家和地區(qū)的增多,人類異尖線蟲(chóng)病在全球已呈擴(kuò)散趨勢(shì)。因此,魚(yú)類異尖線蟲(chóng)病病原的人體感染具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。1993年,異尖線蟲(chóng)病被列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲(chóng)病名錄》。因異尖線蟲(chóng)種類繁多,不同種類的異尖線蟲(chóng)對(duì)人類的致病性有所不同。因此,對(duì)異尖線蟲(chóng)種類進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定不僅是從事異尖線蟲(chóng)研究的基礎(chǔ),也對(duì)防

3、治人和動(dòng)物的異尖線蟲(chóng)病具有重要意義。
　　 本研究以魚(yú)類異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)為研究對(duì)象,對(duì)近年來(lái)廈門(mén)口岸進(jìn)口的各種海水魚(yú)類以及廈門(mén)地區(qū)銷售的多種海水魚(yú)類的異尖線蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果表明藍(lán)鲹(Decapterus maruadsi)、赤棕魚(yú)、竹莢魚(yú)(Trachurus japonicus)的異尖線蟲(chóng)感染率很高,灰海鰻(muraenesox cinereus)、帶魚(yú)(Trichiurus haumela)、大眼鯛(Priacanthus

4、macracanthus)也普遍感染異尖線蟲(chóng),其中藍(lán)圓鲹、竹莢魚(yú)的簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)的感染率達(dá)到100％。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對(duì)檢獲的異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行初步分類后,用通用引物擴(kuò)增異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列片段,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并克隆到pGM-T載體中,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)基因序列對(duì)蟲(chóng)種進(jìn)行鑒定。結(jié)果共獲得簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)、典型異尖線蟲(chóng)、針蛔線蟲(chóng)(Raphidascaris trichiuri)和對(duì)盲囊線蟲(chóng)等4種異尖線蟲(chóng)

5、。以這4種異尖線蟲(chóng)為研究對(duì)象,根據(jù)軟件分析,挑選限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、RsaⅠ對(duì)其ITS序列進(jìn)行酶切試驗(yàn),建立了能準(zhǔn)確、特異和快速地鑒別簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)、典型異尖線蟲(chóng)、針蛔線蟲(chóng)和對(duì)盲囊線蟲(chóng)4種異尖線蟲(chóng)的PCR-RFLP方法。
　　 簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)足我國(guó)海魚(yú)異尖線蟲(chóng)寄生的優(yōu)勢(shì)種,也是感染人體最常見(jiàn)的異尖線蟲(chóng)。本研究第二、三兩章豐要以簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)為研究對(duì)象,根據(jù)其ITS保守序列分別設(shè)計(jì)特異性引物,建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和SYBR

6、 GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)方法,對(duì)LAMP反應(yīng)體系中dNTPs、Mg2+、Betaine和2對(duì)引物的濃度,以及反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)行靈敏性和特異性試驗(yàn),同時(shí)用7份樣品進(jìn)行鑒定。經(jīng)優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系為:0.8mmol/L dNTPs、10mmol/L Mg2+、0.8mmol/L Betaine、0.2μmol/L外引物、1.6μmol/L內(nèi)引物、8U Bst DNA聚合酶大片段、1×ThermoPo

7、l bufer以及適量的模板,反應(yīng)程序?yàn)?62℃反應(yīng)60min,80℃滅活5min。本方法檢測(cè)簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)的靈敏度達(dá)到10拷貝/μL,與典型異尖線蟲(chóng)、對(duì)盲囊線蟲(chóng)、針蛔線蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng),7份樣品鑒定均為陽(yáng)性。本研究建立的簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)熒光定量PCR鑒定方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999:特異性強(qiáng),不能擴(kuò)增典型異尖線蟲(chóng)、對(duì)盲囊線蟲(chóng)和針蛔線蟲(chóng);靈敏性高,可以檢測(cè)到10拷貝/μl的ITS重組質(zhì)粒。結(jié)果表明LAMP方法和SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒

8、光定量PCR法靈敏性高、特異性強(qiáng),都是鑒定簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)的有效手段。其中LAMP法更快速、所需設(shè)備更簡(jiǎn)單、操作更簡(jiǎn)便、費(fèi)用更低,更適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
　　 典型異尖線蟲(chóng)也是引起人異尖線蟲(chóng)病的主要病原之一,國(guó)內(nèi)對(duì)典型異尖線蟲(chóng)的報(bào)道很少。本研究建立了鑒定典型異尖線蟲(chóng)SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法具有快速、特異、敏感、可定量等優(yōu)點(diǎn),是鑒定典型異尖線蟲(chóng)的有效手段。
　　 本研究在國(guó)內(nèi)外首次建立了LAMP技術(shù)