高效液相色譜法測定食品中焦糖色素的含量

1、<p>　　高效液相色譜法測定食品中焦糖色素的含量</p><p>　　摘要：采用沉淀法純化了食品級硫酸銨法焦糖色素，用紅外光譜，紫外光譜，凝膠色譜，元素分析分析了純化后的焦糖色素。建立了威士忌酒、可樂、紅酒、醬油和粉條中焦糖色素的含量。威士忌酒和可樂直接上機(jī)測試，紅酒和醬油樣品用乙醇沉淀，棄去上清，用水重新溶解后上機(jī)測試，粉條樣品用水萃取，萃取液上機(jī)測試。高效液相色譜采用SCX強(qiáng)陽離子交換色譜柱，二極

2、管陣列檢測器。對于威士忌酒、可樂和紅酒，方法檢測限為20 mg/kg，對于醬油和粉條，方法檢測限為100mg/kg。在兩個濃度的添加水平，回收率在81.4%～102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%到8.6%之間。方法準(zhǔn)確、高效，適合食品中焦糖色素含量的測定。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：焦糖色素 食品 高效液相色譜 </p><p>　　Determination of Caramel i

3、n food by liquid chromatography </p><p>　　*** *** *** *** *** </p><p>　　Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute， Guangdong Guangzhou 510110 </p><p>　　Abstract： The food

4、grade ammonium-sulphate-prepared caramel was analyzed by Fourier Transform Infrared Spectrometer， UV-Vis Spectrometer， Gel Permeation Chromatograph and Organic Element Analyzer. A method for determination of the caramel

5、in Barley-bree， Cola， red wine， Soy sauce and Vermicelli by liquid chromatography. Barley-bree and cola samples were tested directly. Red wine and soy sauce samples were precipitated with ethanol， made volume then tested

6、. Vermicelli sample was extract with wate</p><p>　　Keywords：Caramel color； Food； high performance Liquid chromatography </p><p>　　中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A </p><p>　　焦糖色素是以蔗糖、葡萄糖或其他淀粉糖為

7、主要原料，經(jīng)焦化反應(yīng)產(chǎn)生的色素。常規(guī)條件下生產(chǎn)出的焦糖產(chǎn)品包括色素部分和一些糖產(chǎn)品雜質(zhì)。[1-4] GB 8817-2001規(guī)定了采用亞硫酸銨法、氨法、普通法制成的液體和粉末狀焦糖色的技術(shù)要求，試驗方法，檢驗規(guī)則以及包裝、標(biāo)志、貯存、運(yùn)輸要求。其中感官指標(biāo)包括：色澤、外觀形狀、氣味、澄清透明；理化指標(biāo)包括E1cm0.1% （610 nm）吸光度值、干燥失重、氨氮、二氧化硫、4-甲基咪唑、砷、鉛、重金屬、總氮、總汞和總硫。[5] <

8、/p><p>　　焦糖色素的純度檢測，傳統(tǒng)上采用紫外分光光度法。G.E. Mallory & R.F. Love采用電子光譜法檢測陳年酒中的焦糖色素含量。Jana Sádecká & Jana Tóthová采用同步熒光光譜法檢測酒中的焦糖色素含量。[6-9]本文研究采用液相色譜-二極管陣列檢測器檢測威士忌，可樂，醬油，紅酒，粉條中的焦糖色素。方法準(zhǔn)確度高，前處

9、理簡單，是檢測食品中焦糖色素的有效方法。 </p><p><b>　　1、實驗部分 </b></p><p><b>　　1.1 試驗原料 </b></p><p>　　威士忌酒、可樂、醬油、紅酒、粉條：購自市場。 </p><p>　　1.2 試劑和儀器 </p><p>

10、;　　焦糖色素：食品級，DS101，E1cm0.1% （610 nm）=0.30，上海愛普食品工業(yè)有限公司； </p><p>　　無水乙醇、磷酸二氫鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑廠； </p><p>　　超純水：實驗室自制； </p><p>　　高效液相色譜儀：Alliance 2695-2998，美國沃特斯公司； </p><p>　　渦旋

11、混合儀：Minishaker MS3 digital，德國IKA公司； </p><p>　　低速離心機(jī)：中佳 KDC-40，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司； </p><p>　　超聲波清洗儀：KQ-250DV，昆山市超聲儀器有限公司； </p><p>　　天平：PL602-5和XP105，瑞士梅特勒-托利多公司； </p><p>　　超

12、純水儀：Purelab plus，英國威立雅公司； </p><p>　　紫外分光光度計：UV2450，日本島津公司； </p><p>　　元素分析儀： Vario EL cube 元素分析儀，德國Elementar； </p><p>　　紅外光譜儀：VERTEX 70 紅外光譜儀，美國布魯克公司； 　　凝膠色譜柱：ultrahydrogel 1000，美國沃

13、特斯公司； </p><p>　　凝膠色譜水溶性標(biāo)準(zhǔn)品套件：葡聚糖套件，美國沃特斯公司。 </p><p><b>　　1.3 試驗方法 </b></p><p>　　1.3.1 焦糖色素的純化 </p><p>　　稱取8 g液體焦糖于50 mL的塑料離心管中，加入水6 mL，渦旋混勻，再加入乙醇24 mL，渦旋混勻，

14、在45℃下超聲30 min。取出離心管，2000 r/min離心3 min，棄去上層液體。再重復(fù)以上沉淀凈化過程三次。將最終得到的固體沉淀物在烘箱中80℃烘干，黑色固體，該固體的E1cm0.1% （610 nm）=1.22。 </p><p>　　1.3.2 焦糖色素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 </p><p>　　稱取凈化后焦糖色素100 mg 于10 mL容量瓶中，用水定容到刻度。配制成濃度為10

15、 mg/mL焦糖色素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。 </p><p>　　移取一定體積的焦糖色素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL比色管中，用水定容到刻度，配制成濃度分別為0.05 mg/mL， 0.1 mg/mL， 0.2 mg/mL， 0.5 mg/mL，1.0 mg/mL， 2.0 mg/mL的焦糖色素標(biāo)準(zhǔn)工作液。 </p><p>　　1.3.3 色譜條件 </p><p>　　色譜柱：

16、 Waters Spherisorb SCX 5.0 um， 4.6 mm 250 mm； 流速： 0.5 mL/min； 柱溫： 30℃； 進(jìn)樣量： 10 L。流動相：10 mM 磷酸二氫鈉溶液； 等度洗脫，色譜時間10 min； 檢測器掃描波長： 220-700 nm，定量波長610 nm。 </p><p>　　1.3.4 樣品前處理 </p><p>　　威士忌酒和可樂：樣品過0.

17、22?m濾膜后直接上機(jī)測試。 </p><p>　　紅酒：移取2 g紅酒樣品于10 mL玻璃刻度離心管中，加入8 mL乙醇，渦旋混勻，2000 r/min離心3 min，棄去上清液，在離心管中加入2 mL水，溶解沉淀。溶液過0.22 ?m濾膜后上機(jī)測試。 </p><p>　　醬油：移取2 g醬油樣品于10 mL玻璃刻度離心管中，加入8 mL乙醇，渦旋混勻，2000 r/min離心3 mi

18、n，棄去上清液，在離心管中加入10 mL水，溶解沉淀。溶液過0.22 ?m濾膜后上機(jī)測試。 </p><p>　　粉條：稱取粉碎后的粉條樣品1 g于玻璃試管中，加入5 mL水，25℃下超聲萃取5 min。將試管放入離心機(jī)中，2000 r/min離心3 min，上清液過0.22?m濾膜后上機(jī)測試。 </p><p>　　1.3.5 加標(biāo)實驗 </p><p>　　將儲

19、備液加入到樣品中，威士忌酒，可樂，紅酒樣品的加標(biāo)濃度為100 mg/kg和500 mg/L，醬油和粉條樣品的加標(biāo)濃度為500 mg/kg和2000 mg/kg。樣品加標(biāo)放置半小時后進(jìn)行樣品處理和檢測。 </p><p><b>　　2、結(jié)果與討論 </b></p><p>　　2.1 焦糖色素的純化 </p><p>　　焦糖色素中包括了色素成

20、份和其他的小分子雜質(zhì)，如水，低聚糖等。其中色素成分主要為大分子的多糖衍生物混合物。文獻(xiàn)報導(dǎo)了用乙醇/水（4+1）沉淀，膜透析，凝膠色譜等方法對焦糖進(jìn)行純化的方法。其中乙醇/水（4+1）沉淀法最為簡單易行。本研究采用了該方法作為焦糖的凈化方法。液體焦糖經(jīng)過多次沉淀凈化后，在烘箱中烘干，成為松脆的黑色塊狀固體。凈化后的焦糖其E1cm0.1% （610 nm）=1.22，該值相當(dāng)于液體焦糖的四倍。其色素的純度大大提高。 </p>

21、<p>　　黑色固體。元素分析結(jié)果：C，42.53%，H，4.99%，N，5.43%，S，8.45%；紅外光譜分析結(jié)果FTIR（KBr）v =3418，1696，1633，1404，1182，1038，620，522cm-1 ；凝膠色譜分析平均分子量M.W.>1×106。焦糖色素的紅外光譜見圖1。 </p><p>　　圖1. 純化后的焦糖色素紅外光譜圖 </p><

22、;p>　　Figure1. FTIR spectrum of the purify caramel </p><p>　　圖2. 純化后的焦糖色素凝膠色譜圖 </p><p>　　Figure2. GPC chromatogram of the purify caramel </p><p>　　2.2 色譜條件的優(yōu)化 </p><p>

23、;　　由于焦糖色素為高分子混合物，國內(nèi)并無焦糖色素的檢測方法報導(dǎo)。國外的檢測方法也僅限于稱重法，紫外分光光度法，熒光光度法，電子光譜法等。該類方法存在適用范圍小，且存在無法通過色譜方法實現(xiàn)對樣品的分離的不足。 </p><p>　　比較了焦糖色素在C18色譜柱，氨基柱，和強(qiáng)陰離子交換柱三種色譜柱對焦糖色素的色譜分離效果。焦糖色素在C18色譜柱上顯示多個色譜峰，色譜峰之間無法有效分離，且保留時間跨度達(dá)到數(shù)分鐘，無法

24、實現(xiàn)焦糖色素的有效檢測。焦糖色素在氨基柱上顯示為寬峰，且當(dāng)改變流動相中水和有機(jī)溶劑的比例時，色譜峰的峰面積會有很大的變化。這可能是由于焦糖色素與氨基有較強(qiáng)的相互作用力，且焦糖色素在有機(jī)溶劑中溶解度較差的有關(guān)。焦糖色素在強(qiáng)陰離子交換柱中顯示一個尖銳的，對稱的色譜峰。強(qiáng)陰離子交換柱可以有效的分離焦糖色素，且大大的降低了方法的檢測限。因此我們選用強(qiáng)陰離子交換柱作為焦糖色素的分離色譜柱。 </p><p>　　比較了10

25、 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液，20 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液，300 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液，10 mmol磷酸二氫鈉，pH=3.5磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液四種流動相體系，實驗結(jié)果表明，10 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液和20 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液，實驗效果無明顯差異；300 mmol磷酸二氫鈉緩沖溶液會導(dǎo)致焦糖色素的色譜峰明顯變寬變形；pH=3.5磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液會使焦糖色素的響應(yīng)大大降低。因此我們選用了10 mmo

26、l磷酸二氫鈉緩沖溶液作為流動相。 </p><p>　　流動相采用10 mmol的磷酸二氫鈉緩沖溶液，焦糖色素的保留時間為3.3 min，其色譜圖參見圖3，紫外吸收光譜圖參見圖4。 　　2.3 前處理條件的選擇 </p><p>　　由于焦糖色素的檢測波長在610 nm，在該檢測波長的基質(zhì)干擾較少。對于可樂和威士忌樣品，采用過濾膜的簡單前處理方式。對于色素含量較多，成分較為復(fù)雜的紅酒和醬

27、油樣品，采用乙醇沉淀法去除有機(jī)小分子雜質(zhì)，有效的純化了樣品。對于粉條樣品，采用水提取樣品。焦糖色素在水中有極好的溶解性，利用超聲波在常溫下輔助提取，提取效率可以有效的提高。樣品回收率達(dá)到96.7%以上?？蓸?、醬油樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖見圖5～圖6。 </p><p>　　圖3 液體焦糖（A）和純化焦糖（B）色譜圖，濃度1000 mg/L，檢測波長610 nm </p><p>　　Figu

28、re 3. Chromatogram at 610 nm of liquid caramel （A） and purified caramel （B） at 1000 mg/L </p><p>　　圖 4 焦糖色素的紫外光譜圖 </p><p>　　Figure 4 UV absorption spectra of caramel color </p><p>&

29、lt;b>　　2.4 實驗結(jié)果 </b></p><p>　　2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線 </p><p>　　焦糖色素的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.0007x+1.5364，線性范圍50 ～ 2 000 mg/kg，R2值0.9999。 </p><p>　　2.4.2 方法的回收率，精密度和檢測限 </p><p>

30、　　樣品的在兩個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，每個濃度水平取4個平行樣。方法的檢測限采用低濃度添加水平的S/N = 3進(jìn)行計算。回收率實驗結(jié)果見表1。焦糖色素在可樂，威士忌和紅酒中的檢出限為20 mg/kg，在醬油和米粉中的檢出限為100 mg/kg。 </p><p>　　該方法對威士忌，紅酒，粉條的回收率較高，對可樂和醬油的回收率較低。可能是由于該兩種食品中存在抑制焦糖色素響應(yīng)的物質(zhì)。 </p>&

31、lt;p>　　該方法在五種食品基質(zhì)中的平均回收率在81.4～102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3～8.6%之間。方法的準(zhǔn)確性和精密度較好。 </p><p>　　表1 焦糖色素在五種食品中的回收率結(jié)果 （n=4） </p><p>　　Table 1. Recovery studies of caramel in foods （n=4） </p><p>　　圖

32、 5 可樂樣品（A）和可樂加標(biāo)樣品（B）色譜圖 </p><p>　　Figure 5 Chromatogram of Cola and spiked Cola </p><p><b>　　2.5 樣品檢測 </b></p><p>　　經(jīng)檢測，用于加標(biāo)的可樂樣品和醬油樣品中焦糖色素的含量分別為236 mg/kg和1.88×103

33、mg/kg。 </p><p>　　圖 6 醬油樣品（A）和醬油加標(biāo)樣品（B）色譜圖 </p><p>　　Figure 6 Chromatogram of soy sauce and spiked soy sauce </p><p><b>　　3、結(jié)束語 </b></p><p>　　焦糖色素是用途最為廣泛的一種食

34、品色素，本方法首次采用高效液相色譜法檢測食品中的焦糖色素含量，方法前處理簡單，檢測限低，準(zhǔn)確性和精密度較好，是檢測食品中焦糖色素的有效方法，具有巨大的應(yīng)用前景。 </p><p><b>　　4、致謝 </b></p><p>　　本項目受廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項目《食品中焦糖色素的檢測方法研究》支持，項目編號2011cs04. </p><p&

35、gt;<b>　　參考文獻(xiàn)： </b></p><p>　　[1]Cleland J E， Longenecker J B. Caramel color separation [P]. US2533221， 12/12/1950. </p><p>　　[2]Fetzer， W R， Clinton， Iowa. Caramel color manufacture f

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