富勒烯(C60)對(duì)核酸分子的損傷效應(yīng)研究.pdf

1、碳納米材料的毒性效應(yīng)日益受到廣泛關(guān)注。在本研究中，利用不同實(shí)驗(yàn)方法和設(shè)計(jì)多種反應(yīng)條件(溫度，時(shí)間和離子強(qiáng)度等)，來(lái)檢測(cè)富勒烯(C60)以及C60Cu2+在避光條件下對(duì)質(zhì)粒DNA構(gòu)象的影響；并且以mRNA的reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯緾60對(duì)RT反應(yīng)的影響，借以評(píng)估碳納米材料的生物毒性，并闡明C60與生物大分子相互作用關(guān)系及其毒性作用的分

2、子機(jī)制。
　　 C60對(duì)DNA構(gòu)象影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在非光催化條件下，C60可顯著誘導(dǎo)DNA構(gòu)象從超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成開(kāi)環(huán)DNA或線性DNA，并且這種效應(yīng)隨C60濃度的增加，反應(yīng)溫度的升高以及時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；為了研究C60剪切DNA的作用機(jī)制，我們通過(guò)檢測(cè)活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)捕獲劑對(duì)C60剪切DNA作用的影響，來(lái)探討這種剪切效應(yīng)是否與ROS相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單線態(tài)氧(1O2)的捕獲

3、劑均能有效消除C60對(duì)DNA的剪切作用，同時(shí)我們利用商品化試劑盒檢測(cè)反應(yīng)體系中1O2的生成情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二甲基-4-亞硝基苯胺(N，N-Dimethyl-p-nitrosoaniline，RNO)吸光值隨C60濃度的升高，溫度的升高以及時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降；為了研究C60剪切DNA的作用是否具有位點(diǎn)特異性，我們利用不同限制性內(nèi)切酶酶切C60處理后的線性DNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示線性DNA不能被多種限制性內(nèi)切酶酶切成兩個(gè)不同長(zhǎng)度的DNA片段，

4、另外，為了深入探討C60剪切DNA的作用機(jī)制是否與水解相關(guān)，我們利用T4 DNA連接酶連接C60處理后的斷裂DNA，發(fā)現(xiàn)斷裂DNA不能被T4 DNA連接酶連接成超螺旋DNA，但是我們發(fā)現(xiàn)有部分線性DNA被連接成開(kāi)環(huán)DNA；最后，為了研究C60與DNA之間的相互作用關(guān)系，我們利用熒光定量PCR熔解曲線分析C60對(duì)PCR產(chǎn)物Tm值的影響，以及利用UV-Vis分光光度計(jì)檢測(cè)C60對(duì)DNA UV-Vis吸收譜的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C60可顯著降低

5、DNA的Tm值，并且可促使DNA UV-Vis吸收譜發(fā)生紅移現(xiàn)象。上述研究結(jié)果表明在非光催化條件下，C60可誘導(dǎo)DNA構(gòu)象的改變，并且這種效應(yīng)與C60濃度，反應(yīng)溫度和時(shí)間密切相關(guān)；并且C60可與DNA相互作用，改變DNA構(gòu)象穩(wěn)定性；溶液中1O2的生成是C60誘導(dǎo)DNA斷裂的主要原因，并且這種剪切作用沒(méi)有位點(diǎn)特異性。
　　 為了探討金屬離子與C60復(fù)合效應(yīng)對(duì)生物大分子的毒性效應(yīng)，我們研究了多種金屬離子和C60復(fù)合效應(yīng)對(duì)DNA構(gòu)象的

6、影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在非光催化條件下，C60/Mg2+，C60/Mn2+，C60/Ca2+和C60/Zn2+對(duì)質(zhì)粒DNA構(gòu)象沒(méi)有明顯影響，C60/CU2+可顯著誘導(dǎo)DNA構(gòu)象從超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成開(kāi)環(huán)DNA，并且C60/Fe3+可誘導(dǎo)DNA完全降解。通過(guò)檢測(cè)不同濃度Cu2+和C60復(fù)合效應(yīng)對(duì)DNA構(gòu)象的影響，我們發(fā)現(xiàn)在非光催化條件下，C60/Cu2+對(duì)DNA的剪切效應(yīng)隨C60和Cu2+的濃度升高而增強(qiáng)。為了進(jìn)一步研究C60/Cu2+誘導(dǎo)DN

7、A斷裂的作用機(jī)制，我們利用T4 DNA連接酶連接C60/Cu2+反應(yīng)后的斷裂DNA，同時(shí)檢測(cè)不同ROS捕獲劑對(duì)C60/Cu2+剪切DNA作用的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示斷裂DNA被T4 DNA連接酶連接成沒(méi)有缺口的開(kāi)環(huán)DNA，并且不同的ROS捕獲劑均不能有效消除C60對(duì)DNA的剪切作用。上述研究結(jié)果表明在非光催化條件下，C60/Cu2+的復(fù)合效應(yīng)可有效誘導(dǎo)DNA斷裂，并且這種效應(yīng)與C60和Cu2+的濃度密切相關(guān)。
　　 C60對(duì)RT反應(yīng)