曲霉植酸酶基因的克隆及其表達(dá)研究.pdf

1、植酸酶作為一種單胃動(dòng)物飼料添加劑，其飼喂效果已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到確認(rèn)。但目前植酸酶在飼料中的推廣應(yīng)用還相當(dāng)有限，究其原因主要有二：一是天然材料中植酸酶含量太低導(dǎo)致植酸酶生產(chǎn)成本過(guò)高；二是當(dāng)前商業(yè)植酸酶的熱穩(wěn)定性難以完全滿足飼料加工的要求。通過(guò)從自然界篩選具備良好飼用酶潛質(zhì)的植酸酶產(chǎn)生菌，利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得植酸酶基因，再將基因高效表達(dá)在生物反應(yīng)器中是解決上述問(wèn)題的一個(gè)策略，業(yè)已成為植酸酶的世界性研究熱點(diǎn)之一。 本研究從土壤中篩

2、選出一株黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶產(chǎn)生菌和一株煙曲霉(Aspergillus fumigatus)植酸酶產(chǎn)生菌，克隆了二者的植酸酶基因，并將其高效表達(dá)在畢赤酵母中，獲得了性質(zhì)優(yōu)良的基因工程植酸酶。另外，本研究將煙曲霉植酸酶成功表達(dá)在煙草中，首次利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)這類耐熱植酸酶，為其今后的生產(chǎn)開(kāi)辟了一條新途徑，同時(shí)，鑒于植物基因工程在解決作物有效利用土壤有機(jī)磷資源上所具備的潛能，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草在磷脅迫條件下的生長(zhǎng)

3、狀況也進(jìn)行了分析。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.利用植酸鈣平板初篩和搖瓶復(fù)篩的方法，在30℃和45℃分別獲得植酸酶產(chǎn)生菌WY-6和WY-2，酶活力均達(dá)到0.14U/mL。菌株WY-6所產(chǎn)植酸酶的最適pH為3.0，最適溫度為55℃；菌株WY-2所產(chǎn)植酸酶的最適pH為5.5，最適溫度亦為55℃。二者分別被鑒定為黑曲霉菌和煙曲霉菌，在中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心的菌種收錄號(hào)為CICC 40700和CICC 40699。 2.通過(guò)

4、PCR擴(kuò)增的方法獲得來(lái)源于黑曲霉WY-6和煙曲霉WY-2的植酸酶基因全序列，分別命名為phyA(GenBank accessionno.AY745739)和fphyA(GenBank accessionno.AY745738)。phyA全長(zhǎng)1506bp，共編碼467個(gè)氨基酸；fphyA全長(zhǎng)1459bp，共編碼465個(gè)氨基酸。由phyA所推導(dǎo)的氨基酸序列與黑曲霉NRRL3135植酸酶具有97％的同源性；由fphyA所推導(dǎo)的氨基酸序列與煙曲

5、霉ATCC34625植酸酶具有91％的同源性，與黑曲霉NRRL3135植酸酶具有66％的同源性。 3.將phyA克隆到表達(dá)載體pPIC9K中，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，獲得黑曲霉WY-6植酸酶基因工程酵母GS115/phyA。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)60h后，GS115/phyA的產(chǎn)酶達(dá)到最高峰，酶活力達(dá)到28.2U/mL，為出發(fā)菌株酶活力的200倍。經(jīng)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾、陰離子交換層析三個(gè)分離步驟后，重組植酸酶得以純化。純化后的植酸

6、酶比活力為147U/mg，分子量約為67kDa；在pH2.5～6.5范圍內(nèi)均具有較高酶活性，兩個(gè)最適pH分別為3.0和5.5；最適溫度為55℃；以植酸鈉為底物時(shí)的Km為0.112mmol/L，k<,cat>為243/s；與胃蛋白酶以0.01的比率(pepsin/phytase，wt/wt)混合作用2h后，仍保留70.9％的殘余酶活力。 4.將fphyA克隆到表達(dá)載體pPIC9K中，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，獲得煙曲霉WY-2植

7、酸酶基因工程酵母GS115/fphyA。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)60h后，GS115/fphyA的產(chǎn)酶達(dá)到最高峰，酶活力達(dá)到16U/mL，為出發(fā)菌株酶活力的114倍。經(jīng)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾、陰離子交換層析及凝膠過(guò)濾層析四個(gè)分離步驟后，重組植酸酶得以純化。純化后的植酸酶比活力為51U/mg，分子量約為88kDa；僅在酸性范圍內(nèi)呈現(xiàn)酶活性，最適pH為5.5；最適溫度為55℃；具有較高耐熱能力，90℃處理15min后，保留43.8％的殘余酶活力；可水解

8、多種磷酸底物，其中對(duì)植酸鈉的特異性最高，以植酸鈉為底物時(shí)的K<,m>為0.114mmol/L，K<,cat>為102/s；與胃蛋白酶以0.1的比率(pepsin/phytase，wt/wt)混合作用2h后，仍具有90.1％的殘余酶活力；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)受溶液pH值影響，在pH6：0時(shí)的α-螺旋含量最高(35.6％)。 5.將含煙草鈣調(diào)蛋白信號(hào)肽序列的煙曲霉WY-2植酸酶基因組成型表達(dá)在煙草中。PCR鑒定和Southern雜交分析表明

9、植酸酶基因已整合到煙草的基因組DNA中；RT-PCR和Western雜交結(jié)果說(shuō)明植酸酶基因已成功轉(zhuǎn)錄并在蛋白水平上得到表達(dá)。轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)土培4周后達(dá)到了最高的植酸酶表達(dá)水平，其葉片中的植酸酶含量達(dá)到總可溶蛋白的2.3％，酶活力為野生型煙草的13倍。重組植酸酶的分子量約為63kDa；最適pH為5.5；最適溫度為55℃：具有較高耐熱能力，90℃處理15min后，仍保持28.7％的殘余酶活力。 6.在煙草鈣調(diào)蛋白信號(hào)肽的引導(dǎo)下，重組植