非淀粉多糖酶基因篩選及其與植酸酶基因共表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、非淀粉多糖（NSP）是廣泛存在于植物細(xì)胞壁中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，包括纖維素、半纖維素（阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖等）、果膠等物質(zhì)。豬、雞等單胃動物的胃和小腸中缺乏降解這類物質(zhì)的酶，無法充分吸收細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅造成了飼料的浪費，還造成了環(huán)境污染。飼料企業(yè)往往通過添加NSP酶制劑的方式來緩解或消除NSP產(chǎn)生的抗?fàn)I養(yǎng)作用，而酶制劑在飼料制粒、貯藏等過程中易失活，影響了其實際利用價值。此外，在飼料中添加 NSP酶制劑還增加了飼料成本。轉(zhuǎn)

2、基因技術(shù)為上述問題的解決提供了新的思路。本研究從微生物和低等真核生物中篩選了大量 NSP酶基因，通過豬密碼子優(yōu)化及信號肽替換后克隆到pCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體上，瞬時轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞后通過收集細(xì)胞分泌上清分析酶學(xué)性質(zhì)（最適 pH、pH穩(wěn)定性、胃/胰蛋白酶耐受性），以篩選可在豬細(xì)胞中高效表達(dá)的NSP酶基因。經(jīng)基因連接方式的篩選和優(yōu)化及體外細(xì)胞表達(dá)驗證，構(gòu)建了一條多個 NSP酶基因共表達(dá)的多順反子，并構(gòu)建了一個唾液腺特異共表達(dá)多個

3、NSP酶的載體，為新型環(huán)保轉(zhuǎn)基因豬的制備奠定基礎(chǔ)，對我國養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究主要結(jié)果如下：
　?。?）通過對微生物和低等真核生物來源的多個纖維素酶基因的表達(dá)活性及酶學(xué)性質(zhì)分析，篩選到兩個可在豬細(xì)胞中高效表達(dá)出具有較高活性纖維素酶的基因：egII和TeEGI，二者兼具葡聚糖酶活性。在PK15細(xì)胞中，以上兩個基因表達(dá)的纖維素酶和葡聚糖酶活性分別為0.20 U/mL（egII）、0.30 U/mL（TeEGI）（CMC

4、-Na，pH4.00）和0.61 U/mL（egII）、0.66 U/mL（TeEGI）（β-葡聚糖，pH4.62）。
　?。?）通過對微生物源的三個果膠酶基因的表達(dá)活性及酶學(xué)性質(zhì)分析，篩選到兩個可在豬細(xì)胞中高效表達(dá)出具有較高活性果膠酶的基因：PG7fn和 PG。二者在PK15細(xì)胞中表達(dá)的果膠酶最高酶活分別為1.15 U/mL（多聚半乳糖醛酸、pH4.0）和1 U/mL（多聚半乳糖醛酸、pH5.50）。
　　（3）對比分析了

5、三種微生物源木聚糖酶基因（asp-xyn、Xynl11、Penxyl）的表達(dá)活性及酶學(xué)性質(zhì)，篩選到可在豬細(xì)胞中高效表達(dá)木聚糖酶的基因：asp-xyn。以上三種木聚糖酶基因表達(dá)的最高酶活力分別為：1.88 U/mL、1.65 U/mL、0.72 U/mL（木聚糖，pH5.0）。
　?。?）通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建了四條共表達(dá)木聚糖酶和纖維素酶的雙順反子：xyn-flag-egII-T2A，xyn-flag-egII，xyn-egII-

6、T2A，xyn-egII。其中xyn-egII融合效果最好，其木聚糖酶活性為asp-xyn表達(dá)活性的57.35％（pH5.00）；β-葡聚糖酶活性egII表達(dá)活性的46.90%（pH4.50）；CMC的活性為egII表達(dá)活性的67.97%（pH6.00）。
　?。?）成功構(gòu)建pCD-EsAPPA-T2A和pCD-TeEGI-T2A表達(dá)載體，其在PK15細(xì)胞中表達(dá)的酶活性低于單基因表達(dá)活性。
　?。?）優(yōu)化多基因共表達(dá)的連接方