肝銅試驗(yàn)診斷意義

1、楊旭教授簡(jiǎn)介,楊旭教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師， 原中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院感染科主任、湖南省肝病學(xué)專業(yè)委員會(huì)主任委員、湖南省傳染病學(xué)專業(yè)委員會(huì)副主任委員。1981研究生畢業(yè)， 1990在美國(guó)留學(xué)3年。90年代起從事肝病的臨床、教學(xué)和科研，重點(diǎn)研究肝豆?fàn)詈俗冃?，親自診治肝豆?fàn)詈俗冃?90余例，患者來(lái)自全國(guó)各地25個(gè)省市（含香港），建立了肝銅測(cè)定、基因診斷、快速驅(qū)銅等一整套診療新方法，診斷準(zhǔn)確率99.0%，治療有效率95%，出版肝豆?fàn)詈俗冃詫Ｖ?

2、部，論文30余篇。 楊教授即將報(bào)告的關(guān)于肝銅研究的論文已被“Hepatology”接受，已在網(wǎng)上發(fā)表，即將在雜志上發(fā)表，這是肝銅研究領(lǐng)域具有里程碑意義的論文。,肝銅試驗(yàn)診斷意義的前瞻性研究,中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病研究中心楊旭 唐曉鵬 張永紅 羅開(kāi)忠等,一、研究背景和目的,,研究背景,肝豆?fàn)詈俗冃裕╓ilson disease, WD）是重要的遺傳性疾病，1912年Wilson首先詳細(xì)地描述本病四十年代發(fā)現(xiàn)銅的蓄積是本病的原

3、因，1948年Cuming證實(shí)肝、腦銅含量升高1968年Smallwood 在柳葉刀雜志報(bào)告在一些肝病中的肝銅含量，證實(shí)WD肝銅顯著增高，提出診斷WD的標(biāo)準(zhǔn)是≥250μg/g干重,研究背景,但是，以后有多篇論文報(bào)告一些典型WD肝銅少于250μg/g干重2005年Ferenci等發(fā)表肝銅研究論文，包括114例WD，219例其他肝病，提出按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，肝銅試驗(yàn)的敏感性83.3%，最佳臨界值為≥ 75 μg/g。這一標(biāo)準(zhǔn)后來(lái)被美國(guó)和歐洲WD

4、指南引用，也被許多論文引用為什么差別這么大？原因不清楚,存在的問(wèn)題,2003年我院在國(guó)內(nèi)率先建立的肝銅測(cè)定方法，檢查了許多病人。根據(jù)我們自己的臨床觀察，我們感到現(xiàn)有肝銅的診斷標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)際不完全相符。為此，我們系統(tǒng)地復(fù)習(xí)了幾乎所有的肝銅文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)肝銅研究存在幾個(gè)突出的問(wèn)題。,存在的問(wèn)題,1、盡管肝銅試驗(yàn)是WD最重要的的診斷試驗(yàn)，但是其方法沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化。2、以前的研究表明，肝銅的分布是不均勻的。但是，一般用部分肝活檢組識(shí)測(cè)定肝銅，這種方法

5、可能因?yàn)槿诱`差而影響測(cè)定結(jié)果。3、所有肝銅研究都是回顧性，沒(méi)有前瞻性的。4、所有肝銅研究所包括的病例少，病種少，缺少大樣本、多病種研究,研究目的,建立一個(gè)簡(jiǎn)便、可靠的肝銅測(cè)定方法（這是研究肝銅試驗(yàn)的診斷意義的前題）采用前瞻性、多病種、大樣本的方法評(píng)估我們?cè)O(shè)計(jì)的肝銅測(cè)定方法的可靠性探討肝銅試驗(yàn)的最佳診斷標(biāo)準(zhǔn)、敏感性、特異性、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值,二、研究方法,,研究設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)概要：前瞻性隊(duì)列研究時(shí)間：2007年6月—2015年5月

6、地點(diǎn)：中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病中心納入標(biāo)準(zhǔn)：可疑WD患者、WD患者的親屬需要肝活檢者、其它各種需要進(jìn)行肝活檢者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有肝活檢禁忌者、不愿進(jìn)行肝活檢者、WD患者驅(qū)銅治療超過(guò)6月、肝組織小于1mg干重,WD診斷標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)美國(guó)和歐洲WD指南：典型神經(jīng)癥狀、銅藍(lán)蛋白降低、K-F陽(yáng)性、尿銅升高根據(jù)2003年國(guó)際WD會(huì)議提出的計(jì)分診標(biāo)準(zhǔn)： ≥4，診斷WD不典型病例、疑難病例根據(jù)長(zhǎng)期臨床觀察結(jié)果總之，要確保WD診斷準(zhǔn)確無(wú)誤,肝銅測(cè)定方

7、法,B超定位，每人穿刺2針，用1條完整的肝活檢組織測(cè)定肝銅將肝組織置于白紙上，迅速用針頭將肝組織卷成一小團(tuán)將存有肝組織的紙片置于自制的67℃干燥箱2小時(shí)，徹底干燥用萬(wàn)分之一分析天平（METTLER梅特勒E電子天平）準(zhǔn)確稱取總重（紙+肝），用干凈的小刀片將肝組織刮下，置于1.5ml塑料瓶，再稱取紙片的重量，即可獲得肝組織的重量。,肝銅測(cè)定方法,將肝組織送專門(mén)實(shí)驗(yàn)室，采用濃硝酸+過(guò)氯酸（4：1）150 ℃消化，用火焰原子吸收光譜法測(cè)定

8、銅含量。采取三大措施減少測(cè)量誤差，確保測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠：肝組織的處理全部由我完成專業(yè)實(shí)驗(yàn)室、同一技術(shù)人員測(cè)定肝銅每批實(shí)驗(yàn)都設(shè)有對(duì)照肝組織，與待測(cè)肝標(biāo)本平行測(cè)定肝銅,統(tǒng)計(jì)分析,所用統(tǒng)計(jì)分析都是用SPSS軟件完成定量和定性指標(biāo)分別用T試研和卡方試驗(yàn)進(jìn)行顯著性測(cè)定肝銅試驗(yàn)的診斷意義用敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、ROC表示（受試者工作特征性曲線）。用ROC計(jì)算最佳臨界值,三、結(jié)果,,病人入組情況,總肝活檢人數(shù)：3350

9、2次肝活檢及肝銅測(cè)定人數(shù)：714排除例數(shù)：23有效例數(shù)：691總活檢例數(shù)用于肝活檢的安全性分析總有效例數(shù)用于肝銅試驗(yàn)診斷意義分析,各種肝病肝銅含量,疾病種類 例數(shù) 肝銅含量（ 250μg/g干重）肝豆?fàn)詈俗冃?178 770.6±393.2WD雜合子 24 110.7±51.8PBC&PSC 48

10、 318.2±299.7病毒性肝炎 198 50.1±35.3AIH 50 82.1±66.0脂肪肝 40 40.4±28.1 GS&DS 28 37.3±19.7 …

11、…………………………………………..,診斷意義,WD肝銅均值顯著高于其他任何肝病除外PBC和PSC，按常用的診斷標(biāo)準(zhǔn)（≥250μg/g.干重）敏感性：94.4%特異性： 96.8%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值： 91.8%陰性預(yù)測(cè)值： 97.8%,診斷意義,亞型分析：肝型的敏感性：100%兒童型的敏感性：100%ROC顯示最佳臨解值：209μg/g.干重以209μg/g.干重為診斷標(biāo)準(zhǔn)：總敏感性：99.4%總特異性： 96.1%,影

12、響肝銅含量的因素,男女WD患者肝銅無(wú)顯著性差異肝組織炎癥和纖維化程度肝銅含量無(wú)影響兒童肝銅顯著性高于成人肝銅神經(jīng)型肝銅顯著低于其他表型,肝重對(duì)肝銅測(cè)定的影響,肝重(mg) 例數(shù) 平均肝銅 變異系數(shù)(%)1.0~1.5 22 618.4 76.01.6~2.0 46 856.3 51.02.1~2.5 40

13、 710.9 51.82.6~3.0 37 829.9 41.0≥3.1 33 800.4 39.2,肝活檢的并發(fā)癥,活檢后可出現(xiàn)短暫、局部或右肩部不適、疼痛，兩組無(wú)差異少數(shù)患者出現(xiàn)短暫低血壓、肝包膜局部血腫，兩組無(wú)差異，不需特殊處理1例并發(fā)氣胸（肝穿1次），內(nèi)科處理好轉(zhuǎn)無(wú)肝活檢引起的死亡病例,四、討論,

14、,肝銅測(cè)定的難點(diǎn),有創(chuàng)檢查，有一定風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)本微小，干重僅0.5~3.5mg肝銅分布不均勻，樣本越少，取樣誤差越大操作步驟多：活檢、干燥、稱量、消化、光譜分析等，任何一步都有可能造成測(cè)量誤差，影響測(cè)定結(jié)果測(cè)定方法未標(biāo)準(zhǔn)化,減少測(cè)量誤差的關(guān)鍵措施,1、用1條完整的肝組織而不是部分肝組織，以減少取樣誤差2、肝組織置于小片白紙上干燥、稱重，由于皮重很小，可減少稱重的誤差3、銅含量測(cè)定是在經(jīng)國(guó)家質(zhì)量驗(yàn)正認(rèn)可的專門(mén)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4、干燥及稱重

15、全部是我做的，銅含量測(cè)定全部由同一技術(shù)人員做的，減少操作誤差5、每次檢測(cè)設(shè)計(jì)對(duì)照，平行檢測(cè)，觀察是否存在系統(tǒng)誤差,影響肝銅測(cè)定的因素,以前認(rèn)為肝纖維化，特別是肝硬化是影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素，往往把陰性結(jié)果歸因于肝硬化所引起的肝銅分布不均本研究證明，性別、肝臟炎癥程度、肝纖維化程度對(duì)肝銅測(cè)定并無(wú)影響肝銅含量的變異系數(shù)隨肝重增加而減少（1-1.5mg,CV:76.0%; 3.0-3.5m, CV: 39.1%)。肝組織的多小是影響測(cè)定

16、結(jié)果的關(guān)鍵因素,肝銅試驗(yàn)的診斷標(biāo)準(zhǔn),68年提出的標(biāo)準(zhǔn)：≥250μg/g.干重。僅僅根據(jù)少數(shù)WD和其他病人得到的2005年提出的標(biāo)準(zhǔn)：≥75μg/g.干重。依據(jù)：回顧性研究，用部分肝組織測(cè)定肝銅，114例WD，219例其他病人新標(biāo)準(zhǔn)： ≥209μg/g.干重。依據(jù)：前瞻性研究，用整條肝組織測(cè)定肝銅，178例WD，513例其他病人，病種多相信我們的標(biāo)準(zhǔn)更符合實(shí)際,肝銅試驗(yàn)的診斷意義,舊標(biāo)準(zhǔn)(≥250μg/g.干重)敏感性：94.4%

17、特異性：96 .8% 新標(biāo)準(zhǔn)(≥209μg/g.干重)敏感性：99.4%特異性：96 .1%肝銅試驗(yàn)是診斷WD最有價(jià)值的試驗(yàn),重要發(fā)現(xiàn)之一,肝銅沉積的理論：銅最早在肝臟沉積，超過(guò)其最大負(fù)荷后溢出，在頭部及其他組織沉積。按這一理論，神經(jīng)型的肝銅應(yīng)最高。一個(gè)未曾預(yù)料到的發(fā)現(xiàn)是，許多單純神經(jīng)型WD肝臟病例完全正常，其平均肝銅顯著低于其他表型，甚至低于無(wú)癥狀者這一發(fā)現(xiàn)可能具有重要的理論意義。我們提出，體內(nèi)銅的沉積不都是從肝臟開(kāi)始的

18、,重要發(fā)現(xiàn)之二,從理論上來(lái)說(shuō)，如果不治療，WD患者體內(nèi)的銅不斷增加，因此，高齡患者肝銅應(yīng)高于低齡患者。另一未預(yù)料的發(fā)現(xiàn)是兒童WD的平均肝銅顯著高于成人。可能的機(jī)理是：1、銅的蓄積不僅與年齡有關(guān)，更與WD突變的嚴(yán)重性有關(guān)：突變?cè)街?，銅沉積越快，發(fā)病越早。兒童患者突變一般更嚴(yán)重，所以銅更高2、WD動(dòng)物模型表明，肝銅沉積在出生幾月后到高峰，數(shù)月后逐踐降低，這種現(xiàn)象可能與機(jī)體逐踐發(fā)展了不依賴于WD基因的銅平衡機(jī)制有關(guān)。,肝銅試驗(yàn)的特殊意義

19、,1、是確診不典型肝型WD（銅藍(lán)蛋白正?；蜉p度降低，K-F環(huán)陰性，或尿銅正常）最可靠的依據(jù)，敏感性100%，陰性可排除WD2、是確診兒童WD最可靠的依據(jù)，敏感性100%，陰性可排除WD。我們已解決幼兒肝活檢的技術(shù)問(wèn)題。3、是鑒別WD和其他原因所致神經(jīng)癥狀的最可靠的依據(jù)，有時(shí)甚至是唯一依據(jù),肝銅試驗(yàn)的特殊意義,4、肝活檢加肝銅是鑒別WD和WD雜合子最可靠的依據(jù)，有時(shí)甚至是唯一依據(jù)5、是鑒別病毒性肝炎和病毒性肝炎合并WD的最可靠的依據(jù)

20、，有時(shí)甚至是唯一依據(jù)6、是鑒別WD性脂肪肝和非酒精性脂肪肝最可靠的依據(jù)，因?yàn)閮烧吒毋~差異極為顯著,肝銅試驗(yàn)的局限性,1、有創(chuàng)試驗(yàn)，有一定禁忌癥2、其它原因引起的慢性膽汁淤積也可引起肝銅升高，甚至與WD一樣高。典型PBC，PSC，家族性進(jìn)行性肝內(nèi)膽汁淤積等一般不會(huì)與WD混淆不典型PBC，PSC和其它不明原因肝病引起肝銅升高，可誤診WD,隱原性肝銅升高,10年來(lái)，我們遇見(jiàn)10例來(lái)自全國(guó)各大醫(yī)院介紹來(lái)的病例：北京、重慶、四川、吉林、

21、廣西、江西、湖南等地患者均經(jīng)過(guò)系統(tǒng)檢查，原因不明，肝銅都很高，其中5例WD計(jì)分超過(guò)WD診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期觀察，排除WD,鑒別方法,1、K-F和尿銅：兩者都可異常，鑒別意義不大2、肝銅：兩者均可升高，無(wú)法鑒別3、 WD score ：有較大意義，但少數(shù)膽汁淤積可≥44、銅藍(lán)蛋白：意義大，膽汁淤積很少降低5、 GGT、ALP：膽汁淤積多升高，WD極少升高（兒童僅ALP升高）,診斷要點(diǎn),1、對(duì)于肝銅升高的患者，必須考慮隱源性膽汁淤積

22、的可能性2、對(duì)于銅藍(lán)蛋白正常或輕度降低、GGT和ALP升高5倍以升的患者，診斷WD要特別慎重3、如不能排除WD，可試用驅(qū)銅治療。如治療6月~12月無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，排除WD,五、結(jié)論,1、我們?cè)O(shè)計(jì)的肝銅測(cè)定方法是可靠的2、肝銅試驗(yàn)是非常有價(jià)值的診斷方法，其最佳臨界值：≥209μg/g.干重）敏感性：99.4%，特異性： 96.1%3、肝型和兒童WD的敏感性100%，陰性可排除WD4、對(duì)于肝銅升高患者，要考慮隱源性膽汁淤積可能性,謝