天然藥物分析章hplc

1、1,,高效液相色譜法具有應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)在：（1）HPLC不受試樣揮發(fā)性和相對(duì)分子質(zhì)量的限制，可用于分離高沸點(diǎn)、相對(duì)分子量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物，還可用于各種離子的分離；（2）HPLC不僅可利用被分離組分的極性差別，還可利用組分分子尺寸大小的差別、離子交換能力的差別以及生物分子間親和力的差別進(jìn)行分離。它還可以用多種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)于性質(zhì)和結(jié)構(gòu)類(lèi)似的物質(zhì)，分離的可能性比氣相色譜法更大；（3）HPLC易于收集流出物組分，可

2、利用制備柱進(jìn)行較大量的制備。,2,第一節(jié) 高效液相色譜的技術(shù)參數(shù),一．速率理論 圖6-1是氣相色譜法和高效液相色譜法的H-µ曲線。由圖可見(jiàn)，兩者形狀明顯不同。HPLC法接近一條直線，而氣相色譜法曲線中有一極小值。,圖 6-1 GC和HPLC的典型H-μ曲線,3,,在HPLC中，由于流動(dòng)相是液相，影響柱效的因素與GC不完全相同。因此，范第姆特方程（H = A + B/ µ + C µ

3、 ）應(yīng)作修正。 在范第姆特方程中，HPLC與GC的渦流擴(kuò)散項(xiàng)完全相同。 HPLC的分子擴(kuò)散項(xiàng)是因同種組分分子由濃度大的譜帶中心向濃度較低的兩邊擴(kuò)散所引起。它與組分分子的流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)（Dm）成正比，與流動(dòng)相的平均線速（µ）成反比。,,由于液相中擴(kuò)散系數(shù)要比氣相中小4~5個(gè)數(shù)量級(jí)，HPLC中該相對(duì)于譜帶擴(kuò)張的影響可以忽略不計(jì)。,4,,HPLC的傳質(zhì)阻力是由組分在兩相間的傳質(zhì)過(guò)程實(shí)際上不能瞬間達(dá)到

4、平衡而引起的，其傳質(zhì)阻力相包括三項(xiàng)：固定相傳質(zhì)阻力（Hs），移動(dòng)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（Hm）和滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（Hsm），即:,,5,,氣相色譜法主要考慮固定相的傳質(zhì)阻力；液相色譜法與之不同，在整個(gè)傳質(zhì)過(guò)程中起主要作用的是流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，特別是滯留流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力，因此，改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。 以上各項(xiàng)可歸納為：,其中CdDm/u相實(shí)際上可以略去。于是，上式可簡(jiǎn)寫(xiě)為：,,6,,要想提高液相色

5、譜法的柱效，必須用小而均勻的固定相顆粒且要填充均勻，以減小渦流擴(kuò)散和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力。 改進(jìn)固定相的結(jié)構(gòu)，對(duì)于減小滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力以及固定相傳質(zhì)阻力至關(guān)重要。 此外，選用低黏度的流動(dòng)相（如甲醇、乙腈等），也有利于減小傳質(zhì)阻力，提高柱效。,7,二．柱外效應(yīng),柱外效應(yīng)（ extra column effect）是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，又稱(chēng)柱外展寬。它分為柱前和柱后兩種。1．柱前展寬 主要由進(jìn)樣引起。HPLC

6、進(jìn)樣常采用兩種方式：閥門(mén)進(jìn)樣，試樣由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，進(jìn)樣閥有死體積，會(huì)引起峰的展寬；注射進(jìn)樣，將試樣注入液流中，或注入填料頂端，進(jìn)樣器內(nèi)的死體積和進(jìn)樣時(shí)液體擾動(dòng)而引起的擴(kuò)散，均會(huì)引起峰的展寬。 減小進(jìn)樣閥的死體積，或者將試樣直接注射到填料頂端中心點(diǎn)或中心點(diǎn)以?xún)?nèi)1~2mm處，可減少柱前的擴(kuò)散，使柱效顯著提高。,8,2．柱后展寬,是由接管和檢測(cè)器流通池以及檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間等因素引起。流動(dòng)相在接管中心流速較大，而管壁附近流速較慢，管中心

7、處組分比管壁部分先到達(dá)檢測(cè)器，引起峰的展寬。因此盡可能用短的接管，減少流通池體積，可以提高柱效。 檢測(cè)器、放大器和記錄儀響應(yīng)較慢，也會(huì)使描繪的色譜峰寬增加，峰高降低，對(duì)于保留值較小的組分影響尤為突出。所以，改進(jìn)檢測(cè)器和記錄系統(tǒng)的響應(yīng)速度也是克服柱后展寬的一個(gè)途徑。,9,三．分離度,色譜法的關(guān)鍵問(wèn)題之一，就是難分離組分的分離問(wèn)題。前已提出，有效塔板數(shù)（neff），是評(píng)價(jià)柱效應(yīng)的一項(xiàng)指標(biāo)，相對(duì)保留值（ris）是衡量色譜柱選擇性的另一

8、項(xiàng)指標(biāo)。但這兩項(xiàng)指標(biāo)未能說(shuō)明難分離組分的真實(shí)分離效果。 氣相色譜的分離效果可直接表現(xiàn)在色譜的峰間距離和峰寬上，只有相鄰兩個(gè)色譜峰的距離較大、峰寬較窄時(shí)，兩個(gè)組分才能得到良好的分離。 綜合考慮保留值的差值與峰寬對(duì)柱效率的影響，常用分離度作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)，以判斷難分離物質(zhì)對(duì)在色譜柱中的分離情況。,10,,分離度用R表示，其定義為：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰寬平均值之比值，即：,11,,R越大，兩色譜峰距離越

9、遠(yuǎn)，分離效果越好。R < 1時(shí)兩峰有部分重疊；R =1，兩峰有98%的分離；R =1.5時(shí)，分離程度可達(dá)99.7%。當(dāng)R =1.5時(shí)，為相鄰兩峰完全分離標(biāo)志。 為了找出影響分離度的主要因素，可由式（6-8），推導(dǎo)出總分離效能方程式，即： （6-9） 式中， ：柱效相； ：

10、柱選擇相； 容量因子相。,12,13,如何提高分離度,1. 通過(guò)下列方法增加保留時(shí)間（1）選擇合適的分離參數(shù)（2）增加色譜柱長(zhǎng)度（3）增加固定相濃度2. 通過(guò)下列方法降低譜帶寬度（1）使用均一的載體 （2）仔細(xì)填充色譜柱（3）選擇粒度小載體 （4）優(yōu)化流速（5）減少進(jìn)樣量（6）降低系統(tǒng)死體積（7）降低輸出回路響應(yīng)時(shí)間,14,四．系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn),（1）色譜柱的理論塔板數(shù)n：按n = 5.54（tR

11、/W1/2）2 計(jì)算色譜柱的理論塔板數(shù) （2）分離度R：定量分析時(shí)，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度，一般R≥1.5。（3）重復(fù)性：取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0％（4）拖尾因子T：拖尾因子計(jì)算公式 T=W0.05h/2d1 T應(yīng)在0.95~1.05之間。,15,第二節(jié) 高效液相色譜的實(shí)驗(yàn)技術(shù),,高效液相色譜,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

12、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,進(jìn)樣口,檢測(cè)器,色譜圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,色譜柱,溶劑,泵,混合器,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

13、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,16,,一．色譜系統(tǒng) 1. 高壓泵 高壓泵是輸液系統(tǒng)最重要的部件。 理想的泵應(yīng)當(dāng)是：（1）輸出流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，且有較大的可調(diào)范圍；（2）輸出壓力高而且平穩(wěn)；（3）死體積小，便于迅速更換溶劑和采用梯度洗脫；（4）耐腐蝕，保養(yǎng)維修簡(jiǎn)便，壽命長(zhǎng)。,17,2. 梯度洗脫裝置,HPLC有等度洗脫和梯度洗脫兩種洗脫方式：前者保持流動(dòng)相組成配比不變；后者則在洗脫過(guò)程中連續(xù)或階段

14、的改變流動(dòng)相組成，它需要配有梯度洗脫裝置。梯度洗脫裝置有兩類(lèi)：（1）低壓梯度，又稱(chēng)外梯度。先混合后加壓，即按一定程序在常壓下預(yù)先將溶劑混合后，再用泵加壓輸入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)是只需一臺(tái)泵，價(jià)廉。（2）高壓梯度，又稱(chēng)內(nèi)梯度。先加壓，后混合，即用幾臺(tái)泵分別將不同溶劑加壓，按程序規(guī)定的流量比例輸入混合室混合，再使之進(jìn)入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)是方便，能得到任意類(lèi)型的梯度曲線，易于自動(dòng)化；但至少需兩臺(tái)泵，價(jià)格較高。,18,4. 色譜柱,色譜柱是HPLC最

15、重要的部件，由柱管和固定相構(gòu)成。它的作用是分離。HPLC的色譜柱管通常為內(nèi)壁拋光的不銹鋼管，形狀幾乎全為直形。近年來(lái)由于微粒填料和高壓勻漿裝柱技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了柱效。所用色譜柱都比較短（5~30cm），柱內(nèi)徑根據(jù)需要而異；一般分析柱，內(nèi)徑4~5mm：凝膠色譜柱，內(nèi)徑3~12mm；制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。,19,5. 檢測(cè)器,（1）紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器 有固定波長(zhǎng)型和可調(diào)波長(zhǎng)型兩類(lèi) 。紫外檢測(cè)器靈敏度較高，但要

16、求試樣必須有紫外吸收，而且溶劑必須能透過(guò)所選波長(zhǎng)的光，選擇的波長(zhǎng)不能低于溶劑的最低使用波長(zhǎng)。,20,紫外－可見(jiàn)檢測(cè)器,,I0 = 入射光強(qiáng)度,I = 透射光強(qiáng)度,A = 吸光度,a = 摩爾吸光系數(shù),b = 檢測(cè)池長(zhǎng)度,c = 溶質(zhì)濃度,,I,I,,,,,,,,,,,C,b,o,,Detector Cell,,,,,,Log = A = abc,21,（2）光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）,是80年代出現(xiàn)的一

17、種光學(xué)多通道的檢測(cè)器，在晶體硅上緊密排列一系列的光電二極管，二極管越多分辨率越高。一般是一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)的接受光譜上一個(gè)納米譜帶寬的單色光。 二極管陣列檢測(cè)器的工作原理是復(fù)光通過(guò)流動(dòng)池時(shí)，被組分選擇性的吸收，再進(jìn)入單色器，照射在二極管陣列裝置上，使每個(gè)納米波長(zhǎng)的光強(qiáng)變成相應(yīng)的電信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算機(jī)的處理，從而獲得三維光譜—色譜圖。吸收光譜用于組分的定性，色譜峰用于定量，在中藥成分的研究中有廣泛的應(yīng)用。,22,定性分析--峰純度檢驗(yàn)

18、,23,,（3）示差折光率檢測(cè)器（differential refractive index detector） 利用流動(dòng)相中出現(xiàn)試樣組分時(shí)引起折光率的變化進(jìn)行檢測(cè)的。 示差折光率檢測(cè)器是通用型的，可對(duì)所有溶質(zhì)都響應(yīng)，其缺點(diǎn)是不能用于梯度洗脫，且靈敏度較低。由于折光率隨溫度變化，示差折光率檢測(cè)器必須控制恒溫，一般用于無(wú)紫外吸收物質(zhì)分析。,24,,（4）熒光檢測(cè)器 主要特點(diǎn)是高靈敏度，高選擇性，樣品用量少。但相當(dāng)多的物質(zhì)不產(chǎn)

19、生熒光，其應(yīng)用受到一定限制。（5）電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemical detector） 電極活性組分流進(jìn)檢測(cè)器即發(fā)生電解，產(chǎn)生的電流經(jīng)放大而被檢測(cè)。非電極活性物質(zhì)不干擾測(cè)定，因而選擇性很高。檢出限達(dá)pg級(jí)。 （6）電導(dǎo)檢測(cè)器（conductivity detector） 是離子色譜法應(yīng)用最多的檢測(cè)器。 對(duì)于分子不響應(yīng)，對(duì)于離子則是通用型的。電導(dǎo)檢測(cè)器要求溫度恒定，需放在恒溫箱中

20、。雙示差電導(dǎo)檢測(cè)器消除了溫度變化的影響，可測(cè)定10-9mol/L的陰離子，也可編程控制溫度。,25,,（7）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light-scatter detector， ELSD） 是90年代的通用型檢測(cè)器，對(duì)各種物質(zhì)幾乎同時(shí)響應(yīng)，利用在一定的條件下粒子的數(shù)量不變，光散射強(qiáng)度正比于由溶質(zhì)決定的粒子的大小而進(jìn)行測(cè)量的。這就是：樣品結(jié)構(gòu)不需要具備紫外發(fā)色團(tuán)和合適的折射率，對(duì)梯度洗脫和流動(dòng)相系統(tǒng)溫度變化不敏

21、感；對(duì)各種物質(zhì)的響應(yīng)因子很近；在一次的分析中可以同時(shí)檢測(cè)主要成分和雜質(zhì)等。,26,,其工作原理是：將色譜柱流出液引入霧化器與通入的氣體混合形成均勻的微小液滴，經(jīng)過(guò)加熱的漂移管，蒸發(fā)除去流動(dòng)相，而樣品組分形成氣溶膠，然后進(jìn)入檢測(cè)器。用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠，產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測(cè)散射光。 但是，其靈敏度比較低，尤其低于有紫外吸收的組分；此外，流動(dòng)相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽類(lèi)。,27,28,檢測(cè)器使用統(tǒng)計(jì),29,二．色譜分離

22、方式,（一） 吸附色譜法1．原理 吸附色譜法（absorption chromatography）又稱(chēng)液固色譜法（liquid-solid chromatography，LSC），它以固定吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力。試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，它將與流動(dòng)相中的溶劑分子（S）在吸附劑表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附。 達(dá)到平衡時(shí)，有 式中，K：吸附平衡常數(shù)

23、。 K大的強(qiáng)極性組分易被吸附，保留值大，難于洗脫；K小的弱極性組分難被吸附，保留值小，易于洗脫。因此，試樣中的各組分被分離。,,,30,2．固定相,吸附色譜法用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，以硅膠最為常用。硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線型容量較高、機(jī)械性能較好、不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等。 硅膠的吸附活性是由于硅膠表面的硅醇基產(chǎn)生的。硅膠如吸附水，一部分硅醇基與水分子成氫鍵而失去活性，致使吸附力降低。升溫可以除去吸附

24、劑里的水，使硅膠活化。但是溫度不可過(guò)高，否則會(huì)使硅醇基脫去結(jié)構(gòu)水變成硅醚基，反而降低甚至失去吸附力。通常將硅膠在125~150℃干燥8~16h，干燥器中放冷后加入一定量的重蒸餾水調(diào)節(jié)活度，然后裝柱。,31,3．流動(dòng)相,流動(dòng)相的選擇是影響HPLC分離效果的主要因素。HPLC所用的流動(dòng)相又稱(chēng)為洗脫劑（eluant）。 吸附色譜法選擇流動(dòng)相的原則是：極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣應(yīng)用極性較弱的洗脫劑。洗脫劑的極性可用Sny

25、der提出的溶劑極性參數(shù)Pˊ來(lái)表示。 實(shí)際工作中常用混合溶劑作為洗脫劑，以改善分離效果。 在分離復(fù)雜試樣時(shí)，可按一定程序連續(xù)的或階段的改變流動(dòng)相的組成，這就是梯度洗脫（gradient elution）。它類(lèi)似于氣相色譜法中程序升溫所起的作用，能夠提高分離效率，改善峰形，加快分析速度。,32,,流動(dòng)相的優(yōu)化優(yōu)化：指在合理的時(shí)間內(nèi)，所有的流動(dòng)相能使樣品各組分達(dá)到足夠的分離?！斑x擇合適強(qiáng)度的溶劑是獲得分離最佳化的首要

26、條件?！?33,,選擇流動(dòng)相還要注意以下要求，這些要求也適用于其它類(lèi)型的HPLC： （1）不允許使用能引起柱損失或柱保留特性變化的溶劑。如吸附色譜的流動(dòng)相不應(yīng)含水，使用硅膠做填料的色譜柱不能使用堿性溶劑。（2）溶劑純度要高。使用前應(yīng)過(guò)濾，除去塵埃微粒，以免堵塞，還應(yīng)除去溶解的氣體（稱(chēng)為脫氣），以免在柱中或檢測(cè)器中產(chǎn)生氣泡而影響分離和檢測(cè)。 脫氣方式,34,,（3）溶劑對(duì)于試樣要有適量的溶解度，以免試樣在柱中沉淀而造成堵塞

27、。更換流動(dòng)相時(shí)必須保證互溶。（4）流動(dòng)相應(yīng)與檢測(cè)器匹配。如用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相本身在檢測(cè)波長(zhǎng)處應(yīng)當(dāng)無(wú)吸收。 溶劑的截止波長(zhǎng) （5）盡量使用低粘度溶劑，如甲醇、乙腈等可以提高柱效，還能降低色譜柱的阻力。,35,,36,（二）分配色譜法,1．原理分配色譜法（partition chromatography）又稱(chēng)液液色譜法（liquid-liquid chromatography，LLC），是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶（或部分互

28、溶）的液體中溶解度的不同，有不同的分配，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。分配系數(shù)較大的組分，保留值也較大。,37,,根據(jù)固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)極性的大小，可將分配色譜法分為兩類(lèi)：（1）流動(dòng)相極性低而固定相極性高的，稱(chēng)為正相分配色譜法（normal phase partition chromatography）。它對(duì)于極性強(qiáng)的組分有較大的保留值，常用于分離強(qiáng)極性化合物。（2）流動(dòng)相極性大于固定相的，稱(chēng)為反相分配色譜法（reversed phas

29、e partition chromatography）。它對(duì)于極性弱的組分有較大的保留值，適于分離弱極性的化合物。,38,2．固定相,化學(xué)鍵合相（chemically bonded phase）是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的。一般用硅膠作載體，采用的鍵合反應(yīng)有酯化鍵合（Si-O-C型）、硅烷化鍵合（Si-O-Si-C型）和硅氮鍵合（Si-N型）等。其中，以硅烷化鍵合反應(yīng)最為常用,39,,化

30、學(xué)鍵合相具有以下特點(diǎn)：（1）固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高。（2）能耐各種溶劑，可用于梯度洗脫。（3）表面較為均一，沒(méi)有液坑，傳質(zhì)快，柱效高。（4）能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性，例如鍵合氰基、氨基等極性基團(tuán)用于正相色譜法，鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法等。 因此，它是HPLC較為理想的固定相。,40,,根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色譜法。（1）在正相鍵合相色譜

31、法中，鍵合固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。 （2）在反相鍵合相色譜法中，鍵合固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應(yīng)用范圍比正相鍵合相色譜法更廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)在高效液相色譜法中，約70%~80%的分析任務(wù)是由反相鍵合相色譜法來(lái)完成的。,41,3. 流動(dòng)相,分配色譜法所用流動(dòng)相的極性必須與固定相顯著不同。選擇流動(dòng)相一般靠實(shí)驗(yàn)。可以用單一的溶劑，更常用混合溶劑。正相色

32、譜法常用低極性溶劑如烴類(lèi)，加入適量極性溶劑如氯仿、醇類(lèi)以調(diào)節(jié)溶劑極性參數(shù) P’，其溶劑系統(tǒng)的選擇與吸附色譜法相同。反相色譜法中，溶劑的洗脫能力用溶劑強(qiáng)度因子( )表示，其大小順序與正相色譜的P’相反，通常以水或無(wú)機(jī)鹽緩沖溶液為主體，加入甲醇、乙腈等調(diào)節(jié)極性。 梯度洗脫時(shí)，正相色譜法通常逐漸增大洗脫劑中極性溶劑的比例；而反相色譜法則與之相反，逐漸增大極性相對(duì)較低的甲醇或乙腈的比例。,,42,4. 反相離子對(duì)色譜法,離子對(duì)色譜

33、法（ion pair chromatography）是20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的。其中，反相離子對(duì)色譜法應(yīng)用較多，它是在強(qiáng)極性的流動(dòng)相中加入與被測(cè)離子電荷相反的平衡離子，從而實(shí)現(xiàn)色譜分離的。常用的平衡離子試劑有烷基磺酸鈉和季銨鹽兩類(lèi)，前者適用于分離有機(jī)堿類(lèi)和有機(jī)陽(yáng)離子，后者適用于分離有機(jī)酸類(lèi)和有機(jī)陰離子。,43,（三）離子色譜法,離子色譜法（ion chromatography，IC）是由經(jīng)典離子交換色譜法（ion exchange

34、 chromatography，IEC）派生出來(lái)的。它們都是用能交換離子的材料（例如離子交換樹(shù)脂）作為固定相，利用它與流動(dòng)相中試樣離子進(jìn)行可逆的離子交換來(lái)分離離子型化合物的方法。 1．離子交換原理 試樣中的離子與離子交換樹(shù)脂上的離子發(fā)生交換反應(yīng),44,2．離子交換色譜法的固定相和流動(dòng)相,HPLC常用的離子交換填料有以下幾種：（1）多孔樹(shù)脂：直徑為10~20µm。其交換容量較高，但有溶脹性，不耐高壓，而且表面微孔結(jié)構(gòu)

35、影響傳質(zhì)，柱效較低。（2）薄層樹(shù)脂：即在30~40µm直徑的玻珠表面涂一層離子交換樹(shù)脂。其柱效較高，耐壓，但交換容量低。（3）離子性鍵合固定相：在硅膠基體表面鍵合離子交換基團(tuán)而成，制成5或10µm直徑的全多孔微粒。它的機(jī)械性強(qiáng)度較高，化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好，柱效高，交換容量能符合要求，較為理想。,45,,離子交換色譜法大多用一定的pH和一定濃度的緩沖液作為洗脫劑。分離有機(jī)酸堿時(shí)，洗脫劑的pH影響酸堿的解離程

36、度，因而影響k。最好將pH選擇在被分離的酸堿的pKa附近。緩沖液的離子強(qiáng)度也會(huì)影響k。一般來(lái)說(shuō)，離子強(qiáng)度增大，即緩沖溶液濃度增大時(shí)，k減小。對(duì)于多組分混合物的分離，可以采取改變離子強(qiáng)度或改變緩沖液pH兩種梯度洗脫方式。,46,3. 電導(dǎo)檢測(cè)雙柱離子色譜法,離子交換色譜法現(xiàn)代化過(guò)程中遇到的一個(gè)難題是離子的檢測(cè)。使用紫外、熒光等檢測(cè)器只能分析某些具有特殊性質(zhì)的離子。利用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)離子具有通用性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但因洗脫劑中的離子也有

37、響應(yīng)而難以使用。離子色譜法的發(fā)明解決了這個(gè)難題，開(kāi)創(chuàng)了分離分析離子化合物的新局面。 雙柱離子色譜法又稱(chēng)抑制型離子色譜法。該法在分離柱和電導(dǎo)檢測(cè)器之間增加了一根抑制柱（suppressor column），柱中填充電荷與分離柱相反的離子交換樹(shù)脂。洗出液（eluate），即分離柱流出的溶液，進(jìn)入抑制柱發(fā)生抑制反應(yīng)，除去洗脫劑離子，然后就入檢測(cè)器。（1）陰離子分析 （2）陽(yáng)離子分析,47,4．電導(dǎo)檢測(cè)單柱離子色譜

38、法,電導(dǎo)檢測(cè)單柱離子色譜法又稱(chēng)非抑制型離子色譜法。它只用一根分離柱，不用抑制柱。由于減少了抑制柱帶來(lái)的死體積，分離效率高，且能用普通的HPLC儀改裝。該方法近年來(lái)發(fā)展更為迅速。 單柱離子色譜法的基本原理是：（1）采用了低濃度洗脫劑，降低洗出液的本底電導(dǎo)水平。（2）采用了低容量的離子交換樹(shù)脂，使保留值保持不變。,48,,離子色譜法具有靈敏度高、選擇性好、快速、能同時(shí)分析多種離子的優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)于陰離子的分離分析，在各種儀器分析

39、方法中堪稱(chēng)首選方法。在檢測(cè)手段方面，除電導(dǎo)檢測(cè)器以外，還可用柱后衍生技術(shù)，使用其他類(lèi)型的檢測(cè)器。為了防止微量金屬離子的干擾，專(zhuān)用的離子色譜儀通常采用全塑結(jié)構(gòu)。 屬于離子色譜法的還有離子排斥色譜法（ICE）和流動(dòng)相離子色譜法（MPIC）等，可參閱有關(guān)專(zhuān)著。,49,（四）尺寸排阻色譜法,1．原理 尺寸排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC），又稱(chēng)凝膠色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法（gel f

40、iltration chromatography，GFC）、凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）、空間排阻色譜法 它主要用于較大分子的分離。固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)— 凝膠，它不具有吸附、分配和離子交換作用。凝膠的孔徑與被分離組分分子大小相應(yīng)，當(dāng)試樣中大小不同的組分分子隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)凝膠顆粒時(shí)，它們滲入凝膠微孔的程度不同；大分子受排阻不能進(jìn)入微孔，分子越小則進(jìn)入微孔越深，因而滯留時(shí)間

41、不同。試樣中的各組分按照分子大小順序洗脫,50,,,51,2．固定相和流動(dòng)相,凝膠種類(lèi)很多，按強(qiáng)度分軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)凝膠3類(lèi)：（1）軟質(zhì)凝膠，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠，它們適用于水作流動(dòng)相，具有較大的溶脹性，只能在常壓下使用。（2）半硬質(zhì)膠，如交聯(lián)聚苯乙烯，它們比軟質(zhì)膠稍耐壓，是親油性的，宜用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。（3）硬質(zhì)膠，如多孔硅膠，多孔玻璃等，它們可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。但是，由于凝膠孔徑對(duì)于分離至關(guān)重要，用硬質(zhì)膠時(shí)仍

42、應(yīng)注意壓強(qiáng)不宜過(guò)高（<7Mpa），流速不宜過(guò)快（<1ml/min），而且只能緩緩增加，否則會(huì)影響凝膠孔徑和分離效果。,52,（五）親和色譜法,1．原理 親和色譜法（affinity chromatography）是利用生物分子親和力進(jìn)行色譜分離的技術(shù)。生物中許多大分子化合物具有一種特性，能與結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的某種專(zhuān)一分子可逆地結(jié)合。例如酶與底物；抗原與抗體；激素與受體；RNA與和它互補(bǔ)的DNA等。生物分子間的這種結(jié)合力稱(chēng)為親

43、和力。,53,,該方法將可親和的一對(duì)分子的一方，即配基，通過(guò)間隔基手臂以共價(jià)鍵結(jié)合到載體上作為固定相；而另一方面，即親和物則在試樣中。當(dāng)含有親和物的復(fù)雜混合試樣隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，親和物就與配基結(jié)合而與其他組分分離。在其它組分洗脫之后，改變條件以降低親和物與配基的親和力，或使間隔基手臂斷裂，就能使被分離的物質(zhì)洗脫下來(lái)。 親和色譜法特別適用于生物化學(xué)，可用于各種酶、輔酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分離。,54,圖 6-10

44、親和色譜法示意圖,55,2．固定相,親和色譜法的固定相又稱(chēng)親和吸附劑，由載體和配基（L）構(gòu)成。載體要求：（1）具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，易為大分子滲透。（2）具有相當(dāng)數(shù)量可供偶聯(lián)的集團(tuán)，能結(jié)合配基。（3）沒(méi)有吸附性，不發(fā)生非專(zhuān)一吸附。（4）均一，有一定硬度，性質(zhì)穩(wěn)定，親水等。應(yīng)用最多的載體是瓊脂糖凝膠，商品名Sepharose或Bio-Gel A。瓊脂糖凝膠在pH4~9穩(wěn)定，通過(guò)交聯(lián)劑處理的凝膠適用范圍可擴(kuò)大到pH3~12。其他常用的

45、載體還有聚丙烯酰胺載體、葡聚糖凝膠、多孔玻璃等。,56,3．吸附與洗脫,親和色譜法的一般操作方法是：將親和吸附劑裝柱，用緩沖溶液平衡色譜柱，再將待分離的溶液過(guò)柱。為使親和物（X）能緊密結(jié)合在配基上，應(yīng)選擇適當(dāng)pH、離子強(qiáng)度和化學(xué)組成一定的平衡緩沖液，并控制適當(dāng)溫度。試樣上柱后，可用平衡緩沖液或較高離子強(qiáng)度的溶液淋洗，以除去非專(zhuān)一吸附的雜質(zhì)。然后，進(jìn)行親和物的洗脫。,57,第三節(jié) 高效液相色譜的分析應(yīng)用,一．樣品預(yù)處理和色譜柱保護(hù) （

46、一）分析前樣品的處理 1．柱污染來(lái)源2．樣品預(yù)處理的方法 通常原則是處理的樣品極性范圍越窄越好，當(dāng)然要保證待測(cè)組分的最大回收。 ODS反相柱，要求最大程度去掉k’值大的脂溶性雜質(zhì)； 硅膠柱要最大程度去掉極性大即與硅膠吸附大的雜質(zhì)。,58,HPLC法測(cè)定延胡索中叔胺類(lèi)生物堿的含量,主要生物堿有d-紫堇堿（d-corydaline，即延胡索甲素）、dl-四氫巴馬亭（dl-tetrahydropalmatine，即延胡索乙素）

47、、原鴉片堿（protopine，即延胡索丙素）、l-四氫黃連堿（l-tetrahydrocoptisine，即延胡索丁素）、dl-四氫黃連堿（即延胡索戊素）、l-四氫非洲防已堿（l-tetrahydrocolumnamine，即延胡索己素）、延胡索辛素（corydalis H）、延胡索壬素（corydalis I）、延胡索癸素（corydalis J）、延胡索子素（corydalis K）、延胡索丑素（corydalis L）、α-別隱

48、品堿（α-allocryptopine，即延胡索寅素）、紫堇鱗莖堿（corybulbine，即延胡索庚素）、去氫紫堇堿（dehydrocorydaline，即延胡索甲素）、紫堇單酚堿（延胡索胺堿，corydalmine）、去氫延胡索胺（dehydrocorydalmine）、非洲防已堿（columbamine）、巴馬亭（palmatine）等。,59,,樣品制備：取藥材粉末用少量10%氨水潤(rùn)濕，20min后用苯冷浸24h；取一定量苯提取

49、液，減壓蒸干，加1%醋酸溶解，離心或用0.45µm濾膜過(guò)濾，1%醋酸定容作為樣品液。,60,,（1）過(guò)濾或離心方法：采用微孔濾膜、高速離心、超濾等方法，可方便快速清除不溶性物質(zhì)及大分子的植物蛋白、多糖、樹(shù)脂等雜質(zhì)。（2）溶劑提取方法：這是中藥樣品預(yù)處理中最常用的方法之一。如生物堿、有機(jī)酸、中性化合物，首選酸堿提取方法或利用離子對(duì)方法處理生物堿和有機(jī)酸。其次可選用適當(dāng)強(qiáng)度的溶劑，以不同的方式提?。ㄋ魇?、冷浸、滲濾、超聲等）精制

50、。,61,,（3）柱層析：選擇不同的吸附劑如氧化鋁、硅膠、硅藻土、聚酰胺、大孔樹(shù)脂、纖維素、Sephdex LH20等，用不同的洗脫液進(jìn)行處理。該方法的特點(diǎn)是樣品回收率高且回收率值穩(wěn)定。缺點(diǎn)是操作麻煩。 通常情況下：中性氧化鋁填料適合處理生物堿、強(qiáng)心苷；硅藻土適合處理生物堿、有機(jī)酸、中性物質(zhì)；硅酸鎂適合脂溶性物質(zhì)；聚酰胺適于黃酮；大孔樹(shù)脂適于皂苷、多糖；纖維素適于多糖；Sephdex LH20適用于上述所有化合物按分子量大

51、小進(jìn)行分級(jí)。以上凈化過(guò)程不外乎是保留欲測(cè)組分，洗脫除去干擾物質(zhì)。,62,,（4）固相萃?。汗滔嗵盍贤?，把填料做成商品小柱，使用極為方便。但成本相對(duì)較高。 使用中應(yīng)遵循色譜基本原理，根據(jù)樣品的具體情況選擇合適的萃取柱和洗脫液。,63,（二）色譜柱的保護(hù),（1）加保護(hù)柱 （2）凈化樣品（3）流動(dòng)相應(yīng)當(dāng)過(guò)濾處理（4）防止柱中細(xì)菌生長(zhǎng)（5）柱壓需比填充壓力小（6）防止柱子的震動(dòng)和撞擊,64,溶劑過(guò)濾,不干凈的溶劑或在溶劑瓶中

52、長(zhǎng)菌的溶劑會(huì)阻塞溶劑過(guò)濾器，降低泵的操作性能。遵從下列建議可以提高性能，延長(zhǎng)溶劑過(guò)濾器的壽命：使用無(wú)菌溶劑瓶避免溶劑長(zhǎng)菌。用濾膜過(guò)濾溶劑去除微生物。每?jī)商旄鼡Q或過(guò)濾溶劑。避免溶劑瓶直接日照。,65,溶劑信息,避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液。高濃度的無(wú)機(jī)酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過(guò)氧化物的色譜級(jí)醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機(jī)溶

53、劑中的有機(jī)酸溶液。含有強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。,66,正確的進(jìn)樣方式,1.進(jìn)樣量：要么小于定量環(huán)體積的一半，要么滿刻度進(jìn)樣（需要推進(jìn)3~5倍量進(jìn)樣環(huán)體積的樣品，這樣進(jìn)樣才準(zhǔn)確。）2.進(jìn)樣動(dòng)作：在Load狀態(tài)推針，動(dòng)作要平緩，以防樣品沖出，進(jìn)樣后先切換到Inject狀態(tài)，再拔針，以防倒吸而產(chǎn)生氣泡。3.清洗：在Inject狀態(tài)下清洗。4.廢液管的出口末端應(yīng)與進(jìn)樣口水平，以防樣品倒流或產(chǎn)生虹吸。,67,

54、二．在中藥分析中的應(yīng)用,1．應(yīng)用概況 高效液相色譜法在中藥分析的日趨廣泛，已成為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的最常規(guī)分析方法。 如在中藥質(zhì)量規(guī)范化評(píng)價(jià)中占有重要位置，它不僅可以鑒別中藥的真?zhèn)?，區(qū)別類(lèi)同品，還可控制毒劇藥的微量成分限度；既可對(duì)已知有效成分的品種定性定量，又可對(duì)成分未明確或成分復(fù)雜的品種進(jìn)行指征性成分分析。 在進(jìn)行中藥材及中藥注射劑進(jìn)行指紋圖譜分析時(shí)，應(yīng)用最多的方法也是高效液相色譜法。進(jìn)行中藥新藥研究，制定原料藥材和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

55、時(shí)，一般首選的方法同樣是高效液相色譜法。,68,69,第四章 液相色譜分析技術(shù) 的新進(jìn)展,一. 液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用 液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用（LC—MS）集高效分離、多組分同時(shí)定性和定量為一體，是分析混合物最為有效的工具。特別適用于那些高極性、熱不穩(wěn)定性、高相對(duì)分析質(zhì)量和低揮發(fā)性的有機(jī)化合物。 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究開(kāi)始于20世紀(jì)70年代，直到90年代才出現(xiàn)了被廣泛接受的商品

56、接口和配套的儀器。其質(zhì)量分析器主要有磁質(zhì)量分析器、四極桿質(zhì)量分析器和離子阱質(zhì)量分析器等。,70,LC/MS分析特點(diǎn),定性，結(jié)構(gòu)信息，高檢出限檢測(cè)器擴(kuò)展，增加可分析化合物類(lèi)型，線性寬樣品前處理簡(jiǎn)單，部分取代色譜分離適用的待測(cè)物范圍廣，極性、揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性、大分子,71,72,二．超臨界流體色譜法,超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatogrophy，SFC）是以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜法。