第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的原理與技術(shù)

1、第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的原理與技術(shù),一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法 二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法 三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,相關(guān)概念　1.轉(zhuǎn)化(transformation)　　　細(xì)菌獲得外源質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程?！?.轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)　　　以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程?！?.轉(zhuǎn)染 (transfection)　　　指

2、感受態(tài)的受體細(xì)胞捕獲和表達(dá)以噬菌體為載體的重組DNA分子的過程?！∞D(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別　　　轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程。 　　　轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。,（一）轉(zhuǎn)化（transformation）,（1）熱激法（heat shock）,（2）電轉(zhuǎn)化法（electronporation）,（3）PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,（4）接合轉(zhuǎn)化,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿

3、菌的方法,1、化學(xué)轉(zhuǎn)化法　　　　感受態(tài)：細(xì)菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)(competence). 　　　感受態(tài)的出現(xiàn)是由于細(xì)菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)只能與雙鏈DNA結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合。 這說明完整的雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的?！　　τ诖竽c桿菌細(xì)胞，一般采用CaCl2溶液來處理受體細(xì)胞，增加細(xì)胞膜的通透性，制備感受態(tài)細(xì)胞。,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

4、的方法,細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備過程,培養(yǎng)大腸桿菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4℃離心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重懸,4℃離心收集菌,4℃離心收集菌,分裝、-70 ℃凍存,用冰冷的60mMCaCl2重懸,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重懸,,,,,,,,,,,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞,10ng載體DNA,100?L感受態(tài)菌,On ice混合，靜置

5、30分鐘,37℃搖1小時(shí),10-100?L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板,,,,,,,吸附DNA,攝入DNA,加入1mL LB培養(yǎng)基,42ºC 1.5分鐘,熱休克法,簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/?gDNA）。,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌,10-100?L轉(zhuǎn)化液,涂于含抗菌素的平板,37℃過夜,,,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,2.電擊轉(zhuǎn)化法　　 將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化

6、儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。 在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 　　原理: 　用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或擊成小孔，使各種大分子(包括DNA)通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞.,轉(zhuǎn)化效率高（高于109/?gDNA）,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法,LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分鐘，2℃離心集菌,冰冷的水重

7、懸菌體,2 ℃離心集菌,冰冷的水重懸菌體,2 ℃離心收集菌體,少量冰冷的水重懸,分裝成 50-300?L,電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25?F,脈沖控制器200-400?,0.5?g質(zhì)粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培養(yǎng)液,37 ℃中速震蕩60分鐘,10-100?L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板,轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,,,電擊轉(zhuǎn)化法,（二） 轉(zhuǎn)　導(dǎo),由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移過程,（三） 轉(zhuǎn)　染,噬菌體DNA不經(jīng)過蛋

8、白包裝成病毒顆粒，直接被感受態(tài)細(xì)胞捕獲的過程。,與轉(zhuǎn)化無本質(zhì)區(qū)別,體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。每?g ?DNA能形成106個(gè)噬菌斑,現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染,體外包裝過程,二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,1. 利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,酵母,原生質(zhì)體,感受態(tài),酶去壁,CaCl

9、2 PEG,插入外源基因的載體,,,轉(zhuǎn)化,,轉(zhuǎn)化細(xì)胞達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1%~2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%~33%,酵母,0.1mol/L LiCl 處理,,感受態(tài),2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化,,熱激,,,涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子,吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率：103個(gè) / ?g DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少,4. 電擊轉(zhuǎn)化,（1）適于原生質(zhì)體和完整細(xì)胞（2）轉(zhuǎn)化

10、率高，105個(gè) / ?g DNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈,3. PEG1000轉(zhuǎn)化,PEG處理酵母細(xì)胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化,二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞,載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)）DNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA,（二）

11、導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法,將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細(xì)胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株,在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天,葉盤法的具體操作,又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技

12、術(shù)。,金屬微粒加速，進(jìn)入受體細(xì)胞,2. 基因槍法（gene gun）,基因槍,具體操作,植物細(xì)胞,原生質(zhì)體,,纖維素酶和果膠酶,DNA,混合入電擊緩沖液,,,,電擊處理,愈傷組織,,幼苗,分化,,3. 電擊法（電穿孔法）,選擇培養(yǎng),二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞,1. 磷酸鈣沉淀法2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法3. 顯微注射法4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法,（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,原理：,（三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,

13、1. 磷酸鈣沉淀法,通過磷酸鈣-DNA共沉淀，將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞,依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。,操作簡便，成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對細(xì)胞毒性小、效果穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)染效率低。,2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法,脂質(zhì)體包埋DNA，通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。,脂質(zhì)體（lipofectin）載體法,應(yīng)用玻璃顯微注射器，直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。,3. 顯微注射法,1）外源基因制備：線性化

14、的質(zhì)?；蚰康钠?）收集受精卵：受孕后幾小時(shí)內(nèi)3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植,顯微注射法(microinjection),二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入外源DNA。,4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法,,葡聚糖,葡聚糖,,,DEAE-dextran,外源DNA,細(xì)胞,混合,,,,DEAE-dextran對細(xì)胞有毒，常采用低濃度長時(shí)間處理,吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分D

15、NA可以進(jìn)入到細(xì)胞核里。,4. DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法,導(dǎo)入外源DNA的幾種方法,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,轉(zhuǎn)化率（cfu / μgDNA）：每微克重組DNA轉(zhuǎn)化后，接納DNA分子的受體細(xì)胞的個(gè)數(shù)，即陽性克隆數(shù)。,（一）轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：,轉(zhuǎn)化率 ＝ 產(chǎn)生菌落的總數(shù) / DNA的加入量,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,例：取1μl（0.1 ng/μl）完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl的感受態(tài)細(xì)胞。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900μl培養(yǎng)液，讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時(shí)間，取10

16、0μl鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落，轉(zhuǎn)化率為多少？,轉(zhuǎn)化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,例：某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107 cfu / mg 天然載體，經(jīng)酶切和連接處理后的重組載體轉(zhuǎn)化率比天然載體約低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需要投入多少重組載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？,104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a

17、× 20% 重組載體 a = 0.5 mg,三、轉(zhuǎn)化率及影響因素,普通的亞克隆實(shí)驗(yàn)：1×10 6 cfu/μg DNA；更復(fù)雜的亞克?。?×107 cfu/μg DNA，如有限量的DNA的轉(zhuǎn)化，T-A克?。粯?gòu)建文庫：> 1×108 cfu/μg DNA。,1）載體DNA類型、大??；重組DNA濃度、純度2）受體細(xì)胞3）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法技術(shù)參數(shù)影響轉(zhuǎn)化率,（二）轉(zhuǎn)化率的影響因素,